Биљни и патогени материјали
Популацију за мапирање асоцијације сирка, познату као конверзијска популација сирка (SCP), обезбедио је др Пет Браун са Универзитета у Илиноису (сада на Калифорнијском универзитету у Дејвису). Она је раније описана и представља колекцију различитих линија конвертованих у неосетљивост на фотопериод и мањи раст како би се олакшао раст и развој биљака у условима америчког окружења. У овој студији је коришћено 510 линија из ове популације, мада због лоше клијавости и других проблема са контролом квалитета, нису све линије коришћене у анализи све три особине. На крају, подаци из 345 линија су коришћени за анализу одговора на хитин, 472 линије за одговор flg22 и 456 за отпорност на TLS.Б. кукиСој LSLP18 је добијен од др Берта Блума са Универзитета у Арканзасу.
Мерење MAMP одговора
У овој студији коришћена су два различита MAMP-а flg22 (Genscript каталог бр. RP19986) и хитин. Биљке сирка су гајене у улошцима постављеним на равним површинама напуњеним земљом (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) у стакленику. Биљке су заливене дан пре сакупљања узорака како би се избегла додатна влага листова на дан сакупљања.
Линије су биле рандомизоване и, из логистичких разлога, засађене су у серијама од по 60 линија. За сваку линију, засађене су три „саксије“ са по два семена по линији. Накнадне серије су засађене чим је претходна серија обрађена док се не процени цела популација. Спроведена су два експериментална циклуса за оба MAMP-а са генотиповима поново рандомизованим у сваком од два циклуса.
ROS тестови су спроведени као што је претходно описано. Укратко, за сваку линију, шест семена је посађено у 3 различите саксије. Од добијених садница, три су одабране на основу униформности. Саднице које су изгледале необично или су биле значајно више или краће од већине нису коришћене. Четири диска листа пречника 3 мм су исечена из најширег дела 4. листа три различите биљке сирка старе 15 дана. Један диск по листу од две биљке и два диска од једне биљке, при чему је други диск постао контрола воде (видети доле). Дискови су појединачно плутали на 50 µl H20 у црној плочи са 96 бунарића, затворени алуминијумским затварачем како би се избегло излагање светлости, и чувани на собној температури преко ноћи. Следећег јутра је направљен реакциони раствор коришћењем 2 мг/мл хемилуминесцентне сонде L-012 (Wako, каталошки број 120-04891), 2 мг/мл пероксидазе рена (тип VI-A, Sigma-Aldrich, каталошки број P6782) и 100 мг/мл хитина или 2 μM Flg22. 50 µl овог реакционог раствора је додато у три од четири бунарића. Четврти бунар је био лажна контрола, у коју је додат реакциони раствор без MAMP-а. Четири празна бунарића која су садржала само воду су такође била укључена у сваку плочу.
Након додавања реакционог раствора, луминесценција је мерена помоћу Synergy™ 2 вишедетекторског читача микроплоча (BioTek) свака 2 минута током 1 сата. Читач плоча врши мерења луминесценције свака 2 минута током овог 1 сата. Збир свих 31 очитавања је израчунат да би се добила вредност за сваки бунар. Процењена вредност MAMP одговора за сваки генотип је израчуната као (просечна вредност луминесценције три експериментална бунара - вредност у лабораторијском бунару) - минус просечна вредност у празном бунару. Вредности у празним бунарима су биле константно близу нуле.
Лисни дисковиНикотиана бентамијана, једна линија сирка са високим осетљивим реаговањем (SC0003) и једна линија сирка са ниским осетљивим реаговањем (PI 6069) такође су укључене као контроле у сваку плочу са 96 бунарића у сврху контроле квалитета.
Б. кукиприпрема инокулума и инокулација
Б. кукиИнокулум је припремљен као што је претходно описано. Укратко, зрна сирка су натопљена у води три дана, испрана, стављена у конусне боце од 1 литра и аутоклавирана један сат на 15 psi и 121 °C. Зрна су затим инокулирана са око 5 мл мацерираног мицелијума из свеже културеБ. кукиИзолати LSLP18 и остављени су 2 недеље на собној температури, мућкајући бочице свака 3 дана. Након 2 недеље, зрна сирка заражена гљивицом су осушена на ваздуху, а затим складиштена на 4 °C до инокулације на пољу. Исти инокулум је коришћен током целог испитивања и сваке године је правио свеж. За инокулацију, 6–10 заражених зрна је стављено у пршљен биљака сирка старих 4–5 недеља. Споре произведене од ових гљивица покренуле су инфекцију код младих биљака сирка у року од недељу дана.
Припрема семена
Пре садње у поље, семе сирка је третирано мешавином фунгицида, инсектицида и заштитног средства која садржи ~ 1% фунгицида Спирато 480 ФС, 4% фунгицида Себринг 480 ФС и 3% заштитног средства за семе Сорпро 940 ЕС. Затим је семе сушено на ваздуху 3 дана, што је обезбедило танак слој ове мешавине око семена. Заштитно средство је омогућило употребу хербицида Дуал Магнум као третман пре ницања.
Процена отпорности на циљну пегавост лишћа
СЦП је засађен у Централној истраживачкој станици за усеве у Клејтону, Северна Каролина, 14–15. јуна 2017. и 20. јуна 2018. године по рандомизованом комплетном блок дизајну са два експериментална понављања у сваком случају. Експерименти су засађени у појединачним редовима од 1,8 м са ширином реда од 0,9 м, користећи 10 семена по парцели. Два гранична реда су засађена око периферије сваког експеримента како би се спречили ефекти ивице. Експерименти су инокулирани 20. јула 2017. и 20. јула 2018. године, када су биљке сирка биле у фази раста 3. Оцењивање је вршено на скали од један до девет, где су биљке које не показују знаке болести оцењиване са девет, а потпуно мртве биљке са један. Две оцене су извршене 2017. године, а четири очитавања 2018. године, почевши две недеље након инокулације сваке године. sAUDPC (стандардизована површина испод криве прогресије болести) је израчуната као што је претходно описано.
Време објаве: 01. април 2021.