Пестициди играју кључну улогу у решавању глобалне несташице хране и борби против векторских људских болести. Међутим, растући проблем резистенције на пестициде хитно захтева откривање нових једињења која циљају недовољно искоришћене циљеве. Канали потенцијала пролазних рецептора инсеката (TRPV) – Нанџонг (Nan) и неактивни (Iav) – могу формирати хетерологне канале (Nan-Iav) и локализовати се на механосензорним органима који посредују у геотропизму, слуху и проприоцепцији код инсеката. Неки пестициди, као што је афидопиролидон (AP), циљају Nan-Iav кроз непознате механизме. AP је ефикасан против инсеката који пробадају и сишу (hemipterans), спречавајући исхрану нарушавањем функције филамената. AP се може везати само за Nan, али само Nan-Iav може да интерагује са агонистима, укључујући ендогени никотинамид (NAM), чиме показује активност канала. Упркос потенцијалу Nan-Iav као мете инсектицида, мало се зна о његовом склапању канала, регулаторним местима везивања и Ca2+-зависној регулацији, што омета даљи развој инсектицида. У овој студији, криоелектронска микроскопија је коришћена за одређивање структуре Nan-Iav код инсеката Hemiptera у стању без калмодулин-лиганда, као и са AP и NAM на граници анкиринског понављајућег цитоплазматског домена (ARD). Изненађујуће, открили смо да сам Nan протеин може да формира пентамер, који је стабилизован AP-посредованим ARD интеракцијама. Ова студија открива молекуларне интеракције између инсектицида и агониста и Nan-Iav, истичући значај ARD у функцији и склапању канала, и истражујући механизам регулације Ca2+.
У контексту све озбиљнијих глобалних климатских промена, погоршање глобалне безбедности хране један је од главних изазова 21. века, са каскадним последицама по друштво.1,2Извештај Светске здравствене организације о стању безбедности хране и исхране у свету за 2023. годину (SOFI) процењује да приближно 2,33 милијарде људи широм света пати од умерене до тешке несигурности хране, што је дугогодишњи проблем.3,4Нажалост, процењује се да се 20% до 30% или више приноса усева годишње губи због штеточина и патогена, а очекује се да ће глобално загревање погоршати отпорност на штеточине и рањивост усева.4, 5, 6, 7, 8Развој пестицида је кључан не само за заштиту усева од штеточина и смањење ширења векторских патогена, већ и за борбу против векторских људских болести као што су денга грозница, маларија и Чагасова болест, које су све отпорније на пестициде.5, 9, 10, 11
Међу главним метама неуротоксичних инсектицида, хетеротетрамерни TRPV канал Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) представља класу мета инсектицида откривених тек у последњој деценији, укључујући комерцијално доступне инсектициде као што су имидаклоприд и пираклостробин.12, 13, 14Полусинтетички инсектицид афидопиролифен (АП) је недавно развијен и комерцијализован производ чија је главна компонента активни инсектицид Инскалис®, који везује АП на субнаномоларном нивоу активности.15АП показује ниску акутну токсичност за опрашиваче, корисне инсекте и друге организме који нису циљани, а када се користи према упутствима на етикети, може смањити отпорност на друге инсектициде.16, 17, 18Нан и Иав су широко распрострањени међу врстама инсеката, коекспресују се само у неуронима рецептора хордалног истезања антена и удова и критични су за слух, перцепцију гравитације и проприоцепцију.13, 16, 19, 20, 21, 22АП, имидаклоприд и пираклостробин стимулишу Nan-Iav комплекс кроз јединствени механизам, што на крају инхибира проприоцептивну сигналну трансдукцију.13, 16, 23Код инсеката који сишу и пробијају се (хемиптера), као што су лисне уши и беле мушице, губитак проприоцепције нарушава њихову способност храњења, што на крају доводи до смрти.13,24Занимљиво је да АП показује висок афинитет за Nan-Iav комплекс и низак афинитет за сам Nan. Везивање АП за Nan-Iav индукује електричну струју, али везивање за сам Nan не стимулише активност канала. Сам Iav се уопште не везује за АП.16Ово указује на то да се Nan и Iav могу везати и формирати различите Nan-Iav каналске комплексе (нпр. са различитим стехиометријским односима или различитим распоредима унутар истог стехиометријског односа) или да се AP може везати за више места. Штавише, природни агонист никотинамид (NAM) се везује за Drosophila Nan-Iav са микромоларним афинитетом, показујући ефекте сличне онима код лисних уши (AP) in vitro.16,25и спречавање размножавања и исхране лисних уши, што на крају доводи до њихове смрти25,26Ови подаци покрећу многа питања. На пример, остаје нејасно како се формира Nan-Iav хетеродимер, која места везивања се користе за модулацију малих молекула и како ови мали молекули регулишу функцију канала сузбијањем проприоцепције. Штавише, разлози зашто је сам Nan неактиван и има низак афинитет за AP, док је Nan-Iav хетеродимер активан и везује AP са већим афинитетом, остају нејасни. Коначно, мало се зна о Ca2+-зависној регулацији Nan-Iav функције и како је она интегрисана у процесе неуронске сигнализације.13,21
У овој студији, комбинујући крио-електронску микроскопију, електрофизиологију и технике везивања радиолиганда, разјаснили смо склапање Nan-Iav и механизам његовог везивања за регулаторе малих молекула. Штавише, детектовали смо конститутивно везан калмодулин (CaM) за Iav и AP-стабилизоване Nan пентамере. Ови резултати пружају важан увид у регулацију калцијумових јона у каналима, склапање канала и факторе који одређују афинитет везивања лиганда. Још важније, потврдили смо да ARD игра централну улогу у овим процесима. Наша студија комплетних инсекатских канала везаних за релевантне пољопривредне пестициде...27, 28, 29отвара перспективе за развој индустрије пестицида, побољшавајући ефикасност и специфичност пестицида и омогућавајући примену једињења усмерених на TRPV на друге врсте како би се решила глобална безбедност хране и ширење болести које преносе вектори.
Такође смо открили да је Nan-Iav регулисан помоћу Ca2+, а механизам регулације је посредован конститутивно везаним CaM. Важно је напоменути да се ова Ca2+-зависна регулација Nav помоћу CaM значајно разликује од механизама регулације других јонских канала (нпр. напонски контролисаних Na+ канала и TRPV5/6 канала).52, 53, 54, 55, 56, 57У Nav1.2 каналу, C-терминални домен CaM се хеликично повезује са C-терминалним доменом (CTD), а Ca2+ индукује везивање свог N-терминалног домена за дистални део CTD-а.56У TRPV5/6 каналу, C-терминални домен CaM се везује за CTH, а Ca2+ индукује продужење свог N-терминалног домена навише у пору, чиме блокира пропустљивост катјона.53,54Предлажемо модел за Ca2+-регулисану функцију Nan-Iav-CaM (Сл. 4х). У овом моделу, N-терминални домен CaM конститутивно се везује за C-терминални домен (CTH) Iav. У стању мировања (ниска концентрација [Ca2+]), C-терминални домен CaM интерагује са Nan, стабилизујући ARD конформацију и тиме подстичући отварање канала. Везивање агониста/инсектицида за канал индукује отварање пора, што доводи до прилива Ca2+. Ca2+ се затим везује за CaM, узрокујући дисоцијацију C-терминалног домена од ARD Nan-а. Пошто блокирање везивања CaM у суштини укида инхибиторни ефекат Ca2+, ова дисоцијација модулира мобилност ARD-а, чиме узрокује Ca2+-зависну инхибицију или десензитизацију. Брз опоравак каналских струја након елуције калцијумових јона (Сл. 4г) сугерише да овај механизам олакшава брзе одговоре на Ca2+-посредоване неуронске сигнале. Штавише, објављено је да C-терминални регион Iav-а, који је још увек слабо схваћен, игра и друге улоге у циљању канала и регулацији струје.21
Коначно, наша студија представља структуру високе резолуције комплекса инсектицид-инсектицид TRP канала од пољопривредног значаја – откриће које нам је раније било непознато. Приметно је да смо окарактерисали структуру и функцију инсектицидног канала у људским ћелијама (HEK293S GnTi–) а не у ћелијама инсеката. Суочени са растућом отпорношћу на инсектициде и сталним притиском на безбедност хране и патогене, наш рад пружа важне информације које ће олакшати развој нових инсектицида у корист људског здравља и глобалне безбедности хране. Студије су показале да су инсектициди попут AP ефикасни против неких штеточина када се користе према упутствима на етикети и имају ниску акутну токсичност за корисне опрашиваче, што показује њихову безбедност по животну средину.13,16Штавише, тестирање неких АП деривата на комарцима показало је да они на крају губе способност летења. Разумевање како се ова модулирајућа једињења везују за Nan-Iav олакшаће модификацију постојећих једињења или развој нових једињења за ефикасније и...прецизансузбијање штеточина. Наша студија показује да је Nan-Iav ARD интерфејс кључан не само за регулисање активности ендогених једињења, пестицида и Ca2+-CaM, већ и за склапање канала. Сугеришемо да би ометање склапања хетеродимера малим молекулима могло бити јединствен и обећавајући приступ за развој инхибитора јонских канала.
Од осам ортологних гена, одабрани су гени пуне дужине смеђе бубе (Halyomorpha halys) Nanchung и Inactive, који показују одличну стабилност у детерџентима. Синтетизовани гени су оптимизовани кодонима за људску експресију и клонирани у pBacMam pCMV-DEST вектор (Life Technologies) коришћењем рестрикционих места XhoI и EcoRI. Ово је осигурало да су клонови у оквиру са C-терминалним GFP-FLAG-10xHis и mCherry-FLAG-10xHis ознакама, које се цепају HRC-3C протеазом (PPX), омогућавајући независно...изразПрајмери који су коришћени за клонирање Nanchung и Inactive у pBacMam вектор били су следећи:
Микроскопске слике појединачних честица добијене су на трансмисионом електронском микроскопу Titan Krios G2 (FEI) опремљеном K3 камером и енергетским филтером Gatan BioQuantum. Микроскоп је радио на 300 keV, са подешеном енергијом од 20 eV, величином пиксела узорка од 1,08 Å/пиксел (номинално увећање од 81.000x) и градијентом дефокусирања у распону од -0,8 до -2,2 μm. Снимање видеа је извршено брзином од 40 слика у секунди помоћу микроскопа Latitude S (Gatan) са номиналном брзином дозе од 25 e–px−1 s−1, временом експозиције од 2,4 s и укупном дозом од приближно 60 e–Å−2.
Корекција кретања индукована снопом и пондерисање дозе извршени су на филму коришћењем MotionCor2 у RELION 4.061. Процена параметра функције преноса контраста (CTF) извршена је у cryoSPARC коришћењем методе процене CTF засноване на закрпама62. Фотомикрографије са резолуцијом CTF фитовања ≥4 Å искључене су из накнадне анализе. Типично, подскуп од 500–1000 фотомикрографија коришћен је за селекцију тачака у cryoSPARC, након чега је уследило неколико рунди 2D класификације након филтрирања да би се добила јасна референтна слика за селекцију честица засновану на шаблону. Честице су затим екстраховане коришћењем оквира за ограничавање од 64 пиксела и 4-струког биннинга. Извршено је неколико рунди 2D класификације да би се уклониле нежељене категорије честица. Почетни 3D модел је реконструисан коришћењем ab initio реконструкције и рафинисан коришћењем неуниформног рафинирања у cryoSPARC. 3D класификација је извршена у cryoSPARC или RELION на основу хетерогености ARD. Није примећена значајна хетерогеност мембранских домена. Честице су рафиниране коришћењем C1 и C2 метода; Честице са вишом C2 резолуцијом сматране су симетричним у односу на C2 и увезене су у RELION ради Бајесовог пречишћавања. Честице су затим враћене у cryoSPARC ради коначног неуниформног и локалног пречишћавања. Коначна резолуција и број честица приказани су у Табели 1.
Приликом обраде Nan+AP пентамера, истраживали смо различите методе за побољшање резолуције мембранских домена (посебно региона пора), као што су одузимање сигнала и TMD маскирање. Међутим, ови покушаји су били неуспешни због потенцијално екстремног поремећаја у региону пора и укупне хетерогености TMD-а. Коначна резолуција је израчуната коришћењем маске аутоматски генерисане методом неуниформне обраде у cryoSPARC-у, првенствено циљајући ARD регион. Овим је постигнута знатно већа резолуција од мембранских домена (посебно VSLD региона).
Почетни de novo модели апо облика Nanchung и Inactive бактерија прво су генерисани коришћењем Coot63, а модели Nan и Iav бактерија су генерисани коришћењем AlphaFold264 ради идентификације региона ниске поузданости. Моделирање калмодулина је засновано на уклапању крутог тела модела везивања Ca2+ и модела без Ca2+ у PDB приступима 4JPZ56 и 1CFD65, респективно. Модели су рафинирани коришћењем сферног рафинирања како би се осигурала исправна стереохемија и добра геометрија. Фосфатидилхолин, фосфатидилетаноламин и фосфатидилсерин су затим моделирани као добро дефинисане густине липида, а NAM и AP лиганди су смештени у одговарајуће густине у чврстим спојевима. Датотеке ограничења су генерисане из SMILES стринга изоформи коришћењем eLBOW у PHENIX66. Коначно, модели су рафинирани у реалном простору у PHENIX коришћењем локалне претраге мреже и глобалне минимизације са ограничењима секундарне структуре. MolProbity сервер је коришћен за усавршавање модела и структурну анализу, а илустрације су извршене коришћењем PyMOL и UCSF Chimera X. 67,68,69 Анализа отвора бленде је извршена коришћењем HOLE сервера,70 а мапирање конзервације секвенце је извршено коришћењем Consurf сервера.71
Статистичка анализа је спроведена коришћењем програма Igor Pro 6.2, Excel Office 365 и GraphPad Prism 7.0. Сви квантитативни подаци су представљени као средња вредност ± стандардна грешка (SEM). За поређење две групе коришћен је Студентов t-тест (двострани, неупарени). За поређење више група коришћена је једнофакторска анализа варијансе (ANOVA), праћена Данетовим post hoc тестом. *P< 0,05, **П< 0,01 и ***П< 0,001 су сматране статистички значајним у зависности од дистрибуције података. Вредности Kd, Ki и њихови асиметрични интервали поверења од 95% израчунати су помоћу GraphPad Prism 10.
За више детаља о методологији студије, погледајте резиме извештаја о природном портфолију, на који се односи овај чланак.
Почетни модел је изграђен коришћењем калмодулинских модела из база података PDB 4JPZ и 1CFD. Координате су депоноване у Бази података о протеинима (PDB) под приступним бројевима 9NVN (Nan-Iav-CaM без лиганда), 9NVO (Nan-Iav-CaM везан за никотинамид), 9NVP (Nan-Iav-CaM везан за никотинамид и EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM везан за афенидолпиролин и калцијум), 9NVR (Nan-Iav-CaM везан за афенидолпиролин и EDTA) и 9NVS (Nan пентамер везан за афенидолпиролин). Одговарајуће слике добијене крио-електронском микроскопијом депоноване су у Бази података електронске микроскопије (EMDB) под следећим приступним бројевима: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM без лиганда), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM комплекс са никотинамидом), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM комплекс са никотинамидом и EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM комплекс са афидопиролином и калцијумом), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM комплекс са афидопиролином и EDTA) и EMD-49849 (Nan пентамер комплекс са афидопиролином). Необрађени подаци за функционалну анализу представљени су у овом раду.
Време објаве: 28. јануар 2026.