Антихелмински лек N,N-диетил-м-толуамид (ДЕЕТ) је пријављено да инхибира АЦхЕ (ацетилхолинестеразу) и има потенцијална канцерогена својства због прекомерне васкуларизације. У овом раду показујемо да ДЕЕТ специфично стимулише ендотелне ћелије које промовишу ангиогенезу, чиме повећава раст тумора. ДЕЕТ активира ћелијске процесе који доводе до ангиогенезе, укључујући пролиферацију, миграцију и адхезију. Ово је повезано са повећаном продукцијом NO и експресијом VEGF-а у ендотелним ћелијама. Утишавање М3 или употреба фармаколошких М3 инхибитора укинули су све ове ефекте, што сугерише да је ангиогенеза индукована ДЕЕТ-ом осетљива на М3. Експерименти који укључују калцијумову сигнализацију у ендотелним и ХЕК ћелијама које прекомерно експримирају М3 рецепторе, као и студије везивања и доковања, указују да ДЕЕТ делује као алостерни модулатор М3 рецептора. Штавише, ДЕЕТ инхибира АЦхЕ, чиме повећава биодоступност ацетилхолина и његово везивање за М3 рецепторе, и појачава проангиогене ефекте кроз алостерну регулацију.
Примарне ендотеличке ћелије (ЕК) су изоловане из аорте швајцарских мишева. Метод екстракције је адаптиран из Кобајаши протокола 26. Мишје ЕК су култивисане у EBM-2 медијуму допуњеном са 5% топлотно инактивираног FBS до четвртог пасажа.
Ефекат две концентрације DEET-а на пролиферацију HUVEC, U87MG или BF16F10 анализиран је коришћењем CyQUANT комплета за испитивање пролиферације ћелија (Molecular Probes, C7026). Укратко, 5.103 ћелија по бунарићу је посејано у плочу са 96 бунарића, остављено им је да се причврсте преко ноћи, а затим је третирано са DEET-ом током 24 сата. Након уклањања подлоге за раст, додајте раствор за везивање боје у сваки бунар микроплоче и инкубирајте ћелије на 37 °C током 30 минута. Нивои флуоресценције су одређени коришћењем Mithras LB940 мултимодног читача микроплоча (Berthold Technologies, Бад Вилдбад, Немачка) опремљеног филтерима за побуђивање од 485 nm и филтерима за емисију од 530 nm.
HUVEC су посејане у плоче са 96 бунарића у густини од 10⁴ ћелија по бунарићу. Ћелије су третиране DEET-ом током 24 сата. Виталност ћелија је процењена колориметријским MTT тестом (Sigma-Aldrich, M5655). Вредности оптичке густине су добијене на мултимодном читачу микроплоча (Mithras LB940) на таласној дужини од 570 nm.
Ефекти DEET-а су проучавани коришћењем in vitro тестова ангиогенезе. Третман са 10-8 M или 10-5 M DEET-а повећао је формирање дужине капилара у HUVEC ћелијама (Сл. 1а, б, беле траке). У поређењу са контролном групом, третман концентрацијама DEET-а у распону од 10-14 до 10-5 M показао је да је дужина капилара достигла плато при 10-8 M DEET-а (Допунска слика S2). Није пронађена значајна разлика у in vitro проангиогеном ефекту HUVEC ћелија третираних DEET-ом у опсегу концентрација од 10-8 M и 10-5 M.
Да бисмо утврдили ефекат DEET-а на неоваскуларизацију, спровели смо in vivo студије неоваскуларизације. Након 14 дана, мишеви којима су убризгане ендотелне ћелије претходно култивисане са 10-8 M или 10-5 M DEET-а показали су значајно повећање садржаја хемоглобина (Слика 1ц, беле траке).
Штавише, неоваскуларизација индукована DEET-ом проучавана је код мишева са ксенографтом U87MG којима је свакодневно (и.п.) убризгаван DEET у дози за коју се зна да индукује концентрације у плазми од 10-5 M, што је нормално код изложених људи. у 23. Детектабилни тумори (тј. тумори >100 mm3) примећени су 14 дана након ињекције ћелија U87MG у мишеве. На 28. дан, раст тумора је био значајно повећан код мишева третираних DEET-ом у поређењу са контролним мишевима (Слика 1д, квадрати). Штавише, бојење тумора са CD31 показало је да DEET значајно повећава површину капилара, али не и густину микроваскула. (Слика 1е–г).
Да би се утврдила улога мускаринских рецептора у пролиферацији изазваној DETA, коришћено је 10⁻⁶ M или 10⁻⁶ M DETA у присуству pFHHSiD (10⁻⁶ M, селективни антагонист M3 рецептора). Третман HUVEC-а. pFHHSiD је потпуно блокирао пролиферативна својства DETA при свим концентрацијама (Табела 1).
Под овим условима, такође смо испитали да ли би DEET повећао дужину капилара у HUVEC ћелијама. Слично томе, pFHHSiD је значајно спречио дужину капилара индуковану DEET-ом (Сл. 1а, б, сиве траке). Штавише, слични експерименти су спроведени са M3 siRNA. Иако контролна siRNA није била ефикасна у подстицању формирања капилара, утишавање M3 мускаринског рецептора је укинуло способност DEET-а да повећа дужину капилара (Сл. 1а, б, црне траке).
Штавише, и 10-8 M или 10-5 M DEET-индукована васкуларизација in vitro и неоваскуларизација in vivo биле су потпуно блокиране помоћу pFHHSiD (Сл. 1c, d, кругови). Ови резултати указују да DEET промовише ангиогенезу путем осетљивог на селективне антагонисте M3 рецептора или M3 siRNA.
Ацетат етилен-Хе (AChE) је молекуларна мета DEET-а. Лекови попут донепезила, који делују као инхибитори AChE, могу стимулисати ангиогенезу ендотелних ћелија in vitro и у моделима исхемије задњих екстремитета мишева14. Тестирали смо ефекат две концентрације DEET-а на активност ензима AChE у HUVEC ћелијама. Ниске (10-8 M) и високе (10-5 M) концентрације DEET-а смањиле су ендотелну активност AChE у поређењу са контролним условима (Слика 2).
Обе концентрације DEET-а (10-8 M и 10-5 M) смањиле су активност ацетилхолинестеразе на HUVEC ћелијама. BW284c51 (10-5 M) је коришћен као контрола за инхибиторе ацетилхолинестеразе. Резултати су изражени као проценат активности AChE на HUVEC ћелијама третираним са две концентрације DEET-а у поређењу са ћелијама третираним носачем. Вредности су изражене као средња вредност ± SEM шест независних експеримената. *p < 0,05 у поређењу са контролом (Крускал-Волисов и Данов тест вишеструког поређења).
Азотни оксид (NO) је укључен у ангиогени процес 33, стога је проучавана продукција NO у HUVEC ћелијама стимулисаним DEET-ом. Производња NO у ендотелу третирана DEET-ом је повећана у поређењу са контролним ћелијама, али је достигла значајност тек при дози од 10-8 M (Сл. 3ц). Да би се одредиле молекуларне промене које контролишу продукцију NO индуковану DEET-ом, експресија и активација eNOS-а су анализиране Western blotting-ом. Иако третман DEET-ом није променио експресију eNOS-а, значајно је повећао фосфорилацију eNOS-а на његовом активационом месту (Ser-1177), док је смањио његово инхибиторно место (Thr-495) у поређењу са нетретираним ћелијама у фосфорилацији eNOS-а (Сл. 3д). Штавише, однос фосфорилисаног eNOS-а на месту активације и инхибиторном месту је израчунат након нормализације количине фосфорилисаног eNOS-а према укупној количини ензима. Овај однос је значајно повећан у HUVEC ћелијама третираним сваком концентрацијом DEET-а у поређењу са нетретираним ћелијама (Сл. 3д).
Коначно, експресија VEGF-а, једног од главних проангиогених фактора, анализирана је Western blotting-ом. DEET је значајно повећао експресију VEGF-а, док је pFHHSiD потпуно блокирао ову експресију.
Пошто су ефекти DEET-а осетљиви и на фармаколошку блокаду и на смањење регулације M3 рецептора, тестирали смо хипотезу да DEET може појачати сигнализацију калцијума. Изненађујуће, DEET није успео да повећа цитоплазматски калцијум у HUVEC (подаци нису приказани) и HEK/M3 (Сл. 4а, б) за обе коришћене концентрације.
Време објаве: 30. децембар 2024.