Антихелминтички лек Н,Н-диетил-м-толуамид (ДЕЕТ) је пријављено да инхибира АЦхЕ (ацетилхолинестеразу) и да има потенцијална канцерогена својства због прекомерне васкуларизације. У овом раду показујемо да ДЕЕТ специфично стимулише ендотелне ћелије које промовишу ангиогенезу, чиме се повећава раст тумора. ДЕЕТ активира ћелијске процесе који воде до ангиогенезе, укључујући пролиферацију, миграцију и адхезију. Ово је повезано са повећаном производњом НО и експресијом ВЕГФ у ендотелним ћелијама. Утишавање М3 или коришћење фармаколошких инхибитора М3 укида све ове ефекте, што сугерише да је ангиогенеза изазвана ДЕЕТ-ом осетљива на М3. Експерименти који укључују сигнализацију калцијума у ендотелним и ХЕК ћелијама које прекомерно експримирају М3 рецепторе, као и студије везивања и спајања, показују да ДЕЕТ делује као алостерични модулатор М3 рецептора. Штавише, ДЕЕТ инхибира АЦхЕ, чиме се повећава биорасположивост ацетилхолина и његово везивање за М3 рецепторе, и појачавају проангиогене ефекте путем алостеричне регулације.
Примарни ЕЦ су изоловани из аорте швајцарских мишева. Метода екстракције је прилагођена из Кобајаши протокола 26 . Мишји ЕЦ су култивисани у медијуму ЕБМ-2 допуњеном са 5% топлотно инактивираним ФБС до четвртог пролаза.
Ефекат две концентрације ДЕЕТ-а на пролиферацију ХУВЕЦ, У87МГ или БФ16Ф10 је анализиран коришћењем ЦиКУАНТ комплета за испитивање пролиферације ћелија (Молецулар Пробес, Ц7026). Укратко, 5.103 ћелије по бунарчићу су засејане у плочу са 96 бунарчића, остављене да се прикаче преко ноћи, а затим третиране ДЕЕТ-ом током 24 х. Након уклањања медијума за раст, додајте раствор за везивање боје у сваки бунар микроплоче и инкубирајте ћелије на 37 °Ц током 30 минута. Нивои флуоресценције су одређени коришћењем Митхрас ЛБ940 мултимодног читача микроплоча (Бертхолд Тецхнологиес, Бад Вилдбад, Немачка) опремљеног са 485 нм ексцитационим филтерима и 530 нм емисионим филтерима.
ХУВЕЦ су засејане у плоче са 96 јажица при густини од 104 ћелије по бунарчићу. Ћелије су третиране ДЕЕТ-ом током 24 х. Вијабилност ћелија је процењена коришћењем колориметријског МТТ теста (Сигма-Алдрицх, М5655). Вредности оптичке густине су добијене на мултимодном читачу микроплоче (Митхрас ЛБ940) на таласној дужини од 570 нм.
Ефекти ДЕЕТ-а су проучавани коришћењем ин витро тестова ангиогенезе. Третман са 10-8 М или 10-5 М ДЕЕТ повећао је формирање дужине капилара у ХУВЕЦ (Слика 1а, б, беле траке). У поређењу са контролном групом, третман са концентрацијама ДЕЕТ у распону од 10-14 до 10-5 М показао је да је дужина капилара достигла плато на 10-8 М ДЕЕТ (додатна слика С2). Није нађена значајна разлика у ин витро проангиогеном ефекту ХУВЕЦ-а третираних ДЕЕТ-ом у опсегу концентрација од 10-8 М и 10-5 М.
Да бисмо утврдили ефекат ДЕЕТ-а на неоваскуларизацију, урадили смо ин виво студије неоваскуларизације. После 14 дана, мишеви којима су убризгане ендотелне ћелије претходно култивисане са 10-8 М или 10-5 М ДЕЕТ показали су значајно повећање садржаја хемоглобина (слика 1ц, беле траке).
Даље, ДЕЕТ-индукована неоваскуларизација је проучавана код мишева који су носили ксенотрансплантат У87МГ и којима је свакодневно (ип) убризгаван ДЕЕТ у дози за коју је познато да изазива концентрацију у плазми од 10-5 М, што је нормално код изложених људи. у 23. Тумори који се могу детектовати (тј. тумори >100 мм3) примећени су 14 дана након ињекције ћелија У87МГ у мишеве. Дана 28, раст тумора је значајно појачан код мишева третираних ДЕЕТ-ом у поређењу са контролним мишевима (Слика 1д, квадрати). Штавише, ЦД31 бојење тумора показало је да ДЕЕТ значајно повећава површину капилара, али не и густину микро-жила. (Сл. 1е–г).
Да би се утврдила улога мускаринских рецептора у ДЕТА-индукованој пролиферацији, коришћено је 10-8 М или 10-5 М ДЕТА у присуству пФХХСиД (10-7 М, селективни антагонист М3 рецептора). Лечење ХУВЕЦ-а. пФХХСиД је потпуно блокирао пролиферативна својства ДЕТА у свим концентрацијама (Табела 1).
Под овим условима, такође смо испитали да ли ће ДЕЕТ повећати дужину капилара у ХУВЕЦ ћелијама. Слично томе, пФХХСиД је значајно спречио ДЕЕТ-индуковану дужину капилара (сл. 1а, б, сиве траке). Штавише, слични експерименти су изведени са М3 сиРНА. Иако контролна сиРНА није била ефикасна у промовисању формирања капилара, утишавање М3 мускаринског рецептора је укинуло способност ДЕЕТ-а да повећа дужину капилара (Слика 1а, б, црне траке).
Штавише, и 10-8 М или 10-5 М ДЕЕТ-индукована васкуларизација ин витро и неоваскуларизација ин виво су потпуно блокиране пФХХСиД (Слика 1ц, д, кружићи). Ови резултати указују на то да ДЕЕТ промовише ангиогенезу путем пута који је осетљив на селективне антагонисте М3 рецептора или М3 сиРНА.
АЦхЕ је молекуларна мета ДЕЕТ-а. Лекови као што је донепезил, који делују као АЦхЕ инхибитори, могу да стимулишу ЕЦ ангиогенезу ин витро и код модела исхемије задњег удова миша14. Тестирали смо ефекат две концентрације ДЕЕТ-а на активност ензима АЦхЕ у ХУВЕЦ-у. Ниске (10-8 М) и високе (10-5 М) концентрације ДЕЕТ су смањиле ендотелну активност АЦхЕ у поређењу са контролним условима (слика 2).
Обе концентрације ДЕЕТ-а (10-8 М и 10-5 М) су смањиле активност ацетилхолинестеразе на ХУВЕЦ-у. БВ284ц51 (10-5 М) је коришћен као контрола за инхибиторе ацетилхолинестеразе. Резултати су изражени као проценат активности АЦхЕ на ХУВЕЦ третираном са две концентрације ДЕЕТ-а у поређењу са ћелијама третираним носачем. Вредности су изражене као средња вредност ± СЕМ шест независних експеримената. *п < 0,05 у поређењу са контролом (Крускал-Валлис и Дунн тест вишеструког поређења).
Азот оксид (НО) је укључен у ангиогени процес 33, стога је проучавана производња НО у ДЕЕТ-стимулисаним ХУВЕЦ. ДЕЕТ-третирана ендотелна производња НО је повећана у поређењу са контролним ћелијама, али је достигла значај само при дози од 10-8 М (слика 3ц). Да би се одредиле молекуларне промене које контролишу производњу НО изазвану ДЕЕТ-ом, експресија и активација еНОС-а су анализирани Вестерн блот-ом. Иако третман ДЕЕТ-ом није променио експресију еНОС-а, значајно је повећао фосфорилацију еНОС-а на његовом активационом месту (Сер-1177) док је смањио његово инхибиторно место (Тхр-495) у поређењу са нетретираним ћелијама у фосфорилацији еНОС-а (слика 3д). Штавише, однос фосфорилисаног еНОС-а на месту активације и месту инхибитора израчунат је након нормализације количине фосфорилисаног еНОС-а према укупној количини ензима. Овај однос је значајно повећан код ХУВЕЦ третираних са сваком концентрацијом ДЕЕТ-а у поређењу са нетретираним ћелијама (слика 3д).
Коначно, експресија ВЕГФ-а, једног од главних проангиогених фактора, анализирана је Вестерн блот-ом. ДЕЕТ је значајно повећао експресију ВЕГФ, док је пФХХСиД потпуно блокирао ову експресију.
Пошто су ефекти ДЕЕТ-а осетљиви и на фармаколошку блокаду и на смањење регулације М3 рецептора, тестирали смо хипотезу да ДЕЕТ може побољшати сигнализацију калцијума. Изненађујуће, ДЕЕТ није успео да повећа цитоплазматски калцијум у ХУВЕЦ (подаци нису приказани) и ХЕК/М3 (слика 4а, б) за обе коришћене концентрације.
Време поста: 30.12.2024