У овој студији, стимулативни ефекти комбинованог третманарегулатори раста биљакаИспитан је утицај (2,4-Д и кинетина) и наночестица гвожђе оксида (Fe₃O₄-NPs) на in vitro морфогенезу и производњу секундарних метаболита код *Hypericum perforatum* L. Оптимизовани третман [2,4-Д (0,5 мг/Л) + кинетин (2 мг/Л) + Fe₃O₄-NPs (4 мг/Л)] значајно је побољшао параметре раста биљака: висина биљке је повећана за 59,6%, дужина корена за 114,0%, број пупољака за 180,0%, а свежа тежина калуса за 198,3% у поређењу са контролном групом. Овај комбиновани третман је такође побољшао ефикасност регенерације (50,85%) и повећао садржај хиперицина за 66,6%. GC-MS анализа је показала висок садржај хиперозида, β-патолена и цетил алкохола, што чини 93,36% укупне површине врха, док се садржај укупних фенола и флавоноида повећао за чак 80,1%. Ови резултати указују да регулатори раста биљака (PGR) и Fe₃O₄ наночестице (Fe₃O₄-NP) имају синергистички ефекат стимулишући органогенезу и акумулацију биоактивних једињења, што представља обећавајућу стратегију за биотехнолошко унапређење лековитих биљака.
Кантарион (Hypericum perforatum L.), такође познат као кантарион, је вишегодишња зељаста биљка из породице Hypericaceae која има економску вредност.[1] Њене потенцијалне биоактивне компоненте укључују природне танине, ксантоне, флороглуцинол, нафталендиантрон (хиперин и псеудохиперин), флавоноиде, фенолне киселине и етерична уља.[2,3,4] Кантарион се може размножавати традиционалним методама; међутим, сезонскост традиционалних метода, ниска клијавост семена и подложност болестима ограничавају њен потенцијал за узгој великих размера и континуирано формирање секундарних метаболита.[1,5,6]
Стога се култура ткива in vitro сматра ефикасном методом за брзо размножавање биљака, очување ресурса герминативне плазме и повећање приноса лековитих једињења [7, 8]. Регулатори раста биљака (PGR) играју кључну улогу у регулисању морфогенезе и неопходни су за in vitro култивацију калуса и целих организама. Оптимизација њихових концентрација и комбинација је кључна за успешно завршетак ових развојних процеса [9]. Стога је разумевање одговарајућег састава и концентрације регулатора важно за побољшање раста и регенеративног капацитета кантариона (H. perforatum) [10].
Наночестице гвожђе оксида (Fe₃O₄) су класа наночестица које су развијене или се развијају за културу ткива. Fe₃O₄ има значајна магнетна својства, добру биокомпатибилност и способност да подстакне раст биљака и смањи стрес из околине, па је привукао значајну пажњу у дизајну култура ткива. Потенцијалне примене ових наночестица могу укључивати оптимизацију in vitro културе ради подстицања деобе ћелија, побољшања уноса хранљивих материја и активирања антиоксидативних ензима [11].
Иако су наночестице показале добре подстицајне ефекте на раст биљака, студије о комбинованој примени Fe₃O₄ наночестица и оптимизованих регулатора раста биљака код *H. perforatum* остају оскудне. Да би се попунила ова празнина у знању, ова студија је проценила ефекте њихових комбинованих ефеката на in vitro морфогенезу и производњу секундарних метаболита како би се пружили нови увиди за побољшање карактеристика лековитих биљака. Стога, ова студија има два циља: (1) оптимизовати концентрацију регулатора раста биљака како би се ефикасно подстакло формирање калуса, регенерација изданака и укорењивање in vitro; и (2) проценити ефекте Fe₃O₄ наночестица на параметре раста in vitro. Будући планови укључују процену стопе преживљавања регенерисаних биљака током аклиматизације (in vitro). Очекује се да ће резултати ове студије значајно побољшати ефикасност микропропагације *H. perforatum*, чиме ће допринети одрживој употреби и биотехнолошким применама ове важне лековите биљке.
У овој студији, добили смо експлантате листова са једногодишњих биљака кантариона узгајаних на пољу (матичне биљке). Ови експлантати су коришћени за оптимизацију услова културе in vitro. Пре културе, листови су темељно испрани под млазом дестиловане воде неколико минута. Површине експлантата су затим дезинфиковане потапањем у 70% етанол током 30 секунди, а затим потапањем у 1,5% раствор натријум хипохлорита (NaOCl) који садржи неколико капи Tween 20 током 10 минута. Коначно, експлантати су три пута испрани стерилном дестилованом водом пре него што су премештени у следећи медијум за култивацију.
Током наредне четири недеље, мерени су параметри регенерације изданака, укључујући брзину регенерације, број изданака по експлантату и дужину изданака. Када су регенерисани изданци достигли дужину од најмање 2 цм, пребачени су у медијум за укорењивање који се састојао од MS медијума упола јаче, 0,5 мг/Л индолбутерне киселине (IBA) и 0,3% гуар гуме. Култура укорењивања настављена је три недеље, током којих су мерени брзина укорењивања, број корена и дужина корена. Сваки третман је поновљен три пута, са 10 експлантата култивисаних по понављању, што је дало приближно 30 експлантата по третману.
Висина биљке је мерена у центиметрима (цм) помоћу лењира, од основе биљке до врха највишег листа. Дужина корена је мерена у милиметрима (мм) одмах након пажљивог вађења садница и уклањања супстрата за узгој. Број пупољака по експлантату је пребројан директно на свакој биљци. Број црних тачака на листовима, познатих као нодули, мерен је визуелно. Верује се да су ови црни нодули жлезде које садрже хиперицин, или оксидативне пеге, и користе се као физиолошки индикатор одговора биљке на третман. Након уклањања целог супстрата за узгој, свежа тежина садница је мерена помоћу електронске ваге са тачношћу од милиграма (мг).
Метод за израчунавање брзине формирања калуса је следећи: након култивације експлантата у медијуму који садржи различите регулаторе раста (киназе, 2,4-D и Fe3O4) током четири недеље, броји се број експлантата способних за формирање калуса. Формула за израчунавање брзине формирања калуса је следећа:
Сваки третман је поновљен три пута, са најмање 10 експлантата испитаних у сваком понављању.
Стопа регенерације одражава удео калусног ткива који успешно завршава процес диференцијације пупољака након фазе формирања калуса. Овај индикатор показује способност калусног ткива да се трансформише у диференцирано ткиво и расте у нове биљне органе.
Коефицијент укорењавања је однос броја грана способних за укорењавање и укупног броја грана. Овај индикатор одражава успех фазе укорењавања, што је кључно у микропропагацији и размножавању биљака, јер добро укорењавање помаже садницама да боље преживе у условима раста.
Једињења хиперицина су екстрахована са 90% метанолом. Педесет мг осушеног биљног материјала је додато у 1 мл метанола и соницирано 20 минута на 30 kHz у ултразвучном чистачу (модел A5120-3YJ) на собној температури у мраку. Након соницирања, узорак је центрифугиран на 6000 о/мин током 15 минута. Супернатант је сакупљен, а апсорбанција хиперицина је мерена на 592 nm коришћењем Plus-3000 S спектрофотометра према методи коју су описали Conceiçao et al. [14].
Већина третмана регулаторима раста биљака (PGR) и наночестицама гвожђе оксида (Fe₃O₄-NP) није изазвала стварање црних чворића на регенерисаним листовима изданака. Нису примећени чворићи ни у једном од третмана са 0,5 или 1 мг/Л 2,4-D, 0,5 или 1 мг/Л кинетина, или 1, 2 или 4 мг/Л наночестица гвожђе оксида. Неколико комбинација је показало благо повећање развоја чворића (али не статистички значајно) при вишим концентрацијама кинетина и/или наночестица гвожђе оксида, као што је комбинација 2,4-D (0,5–2 мг/Л) са кинетином (1–1,5 мг/Л) и наночестицама гвожђе оксида (2–4 мг/Л). Ови резултати су приказани на слици 2. Црни чворићи представљају жлезде богате хиперицином, које се јављају природно и корисне су. У овој студији, црни чворићи су углавном били повезани са потамњивањем ткива, што указује на повољно окружење за акумулацију хиперицина. Третман са 2,4-D, кинетином и Fe₃O₄ наночестицама подстакао је раст калуса, смањио потамњивање и повећао садржај хлорофила, што указује на побољшану метаболичку функцију и потенцијално смањење оксидативног оштећења [37]. Ова студија је проценила ефекте кинетина у комбинацији са 2,4-D и Fe₃O₄ наночестицама на раст и развој калуса кантариона (Сл. 3а–г). Претходне студије су показале да Fe₃O₄ наночестице имају антифунгална и антимикробна дејства [38, 39] и, када се користе у комбинацији са регулаторима раста биљака, могу стимулисати одбрамбене механизме биљака и смањити индексе ћелијског стреса [18]. Иако је биосинтеза секундарних метаболита генетски регулисана, њихов стварни принос у великој мери зависи од услова околине. Метаболичке и морфолошке промене могу утицати на нивое секундарних метаболита регулисањем експресије специфичних биљних гена и реаговањем на факторе околине. Штавише, индуктори могу покренути активацију нових гена, што заузврат стимулише ензимску активност, што на крају активира више биосинтетских путева и доводи до формирања секундарних метаболита. Штавише, друга студија је показала да смањење сенчења повећава изложеност сунчевој светлости, чиме се повећавају дневне температуре у природном станишту *Hypericum perforatum*, што такође доприноси повећаном приносу хиперицина. На основу ових података, ова студија је истраживала улогу наночестица гвожђа као потенцијалних индуктора у култури ткива. Резултати су показали да ове наночестице могу активирати гене укључене у биосинтезу хесперидина путем ензимске стимулације, што доводи до повећане акумулације овог једињења (Сл. 2). Стога, у поређењу са биљкама које расту у природним условима, може се тврдити да се производња таквих једињења in vivo такође може побољшати када се умерени стрес комбинује са активацијом гена укључених у биосинтезу секундарних метаболита. Комбиновани третмани генерално имају позитиван ефекат на брзину регенерације, али у неким случајевима овај ефекат је ослабљен. Приметно је да третман са 1 мг/Л 2,4-Д, 1,5 мг/Л киназе и различитим концентрацијама може независно и значајно повећати брзину регенерације за 50,85% у поређењу са контролном групом (Сл. 4ц). Ови резултати указују на то да специфичне комбинације нанохормона могу деловати синергистички како би подстакле раст биљака и производњу метаболита, што је од великог значаја за културу ткива лековитих биљака. Палмер и Келер [50] су показали да третман са 2,4-Д може независно да индукује формирање калуса код St. perforatum, док додавање киназе значајно побољшава формирање и регенерацију калуса. Овај ефекат је последица побољшања хормонске равнотеже и стимулације деобе ћелија. Бал и др. [51] су открили да третман са Fe₃O₄-NP може независно да побољша функцију антиоксидативних ензима, чиме се подстиче раст корена код St. perforatum. Подлоге за култивацију које садрже Fe₃O₄ наночестице у концентрацијама од 0,5 мг/Л, 1 мг/Л и 1,5 мг/Л побољшале су брзину регенерације биљака лана [52]. Употреба кинетина, 2,4-дихлоробензотиазолинона и Fe₃O₄ наночестица значајно је побољшала брзину формирања калуса и корена, међутим, потребно је узети у обзир потенцијалне нежељене ефекте коришћења ових хормона за ин витро регенерацију. На пример, дуготрајна или употреба 2,4-дихлоробензотиазолинона или кинетина у високим концентрацијама може довести до соматске клонске варијације, оксидативног стреса, абнормалне морфологије калуса или витрификације. Стога, висока стопа регенерације не мора нужно предвидети генетску стабилност. Све регенерисане биљке треба проценити коришћењем молекуларних маркера (нпр. RAPD, ISSR, AFLP) или цитогенетске анализе како би се утврдила њихова хомогеност и сличност са биљкама in vivo [53,54,55].
Ова студија је први пут показала да комбинована употреба регулатора раста биљака (2,4-Д и кинетина) са Fe₃O₄ наночестицама може побољшати морфогенезу и акумулацију кључних биоактивних метаболита (укључујући хиперицин и хиперозид) код *Hypericum perforatum*. Оптимизовани режим третмана (1 мг/Л 2,4-Д + 1 мг/Л кинетина + 4 мг/Л Fe₃O₄-NP) не само да је максимизирао формирање калуса, органогенезу и принос секундарних метаболита, већ је показао и благи индукујући ефекат, потенцијално побољшавајући толеранцију биљке на стрес и њену медицинску вредност. Комбинација нанотехнологије и културе биљног ткива пружа одрживу и ефикасну платформу за производњу лековитих једињења in vitro великих размера. Ови резултати отварају пут индустријским применама и будућим истраживањима молекуларних механизама, оптимизације дозирања и генетске прецизности, повезујући тако фундаментална истраживања лековитих биљака са практичном биотехнологијом.
Време објаве: 12. децембар 2025.