Раст апикалног меристема (SAM) изданка је кључан за архитектуру стабљике. Биљни хормонигиберелини(ГА) играју кључну улогу у координацији раста биљака, али њихова улога у SAM-у је још увек слабо схваћена. Овде смо развили ратиометријски биосензор ГА сигнализације инжењерингом ДЕЛЛА протеина како бисмо сузбили његову есенцијалну регулаторну функцију у транскрипционом одговору ГА, а истовремено очували његову деградацију након препознавања ГА. Показали смо да овај биосензор заснован на деградацији прецизно бележи промене у нивоима ГА и ћелијском сензору током развоја. Користили смо овај биосензор за мапирање активности ГА сигнализације у SAM-у. Показали смо да су високи ГА сигнали присутни претежно у ћелијама које се налазе између примордија органа, које су прекурсори ћелија интернодија. Користећи приступе добитка и губитка функције, даље показујемо да ГА регулише оријентацију равни ћелијске деобе, успостављајући канонску ћелијску организацију интернодија, чиме промовише спецификацију интернодија у SAM-у.
Апикални меристем изданка (SAM), који се налази на врху изданка, садржи нишу матичних ћелија чија активност генерише бочне органе и стабљичне чворове на модуларан и итеративан начин током целог живота биљке. Свака од ових понављајућих јединица, или биљних чворова, укључује интернодије и бочне органе на чворовима, и аксиларне меристеме у пазуху листа1. Раст и организација биљних чворова мењају се током развоја. Код Arabidopsis-а, интернодални раст је потиснут током вегетативне фазе, а аксиларни меристеми остају успавани у пазуху листова розете. Током преласка у цветну фазу, SAM постаје цвастни меристем, генеришући издужене интернодије и аксиларне пупољке, гранчице у пазуху стабљика, а касније и цветове без листа2. Иако смо постигли значајан напредак у разумевању механизама који контролишу појаву листова, цветова и грана, релативно мало се зна о томе како настају интернодији.
Разумевање просторно-временске дистрибуције ГА помоћи ће да се боље разумеју функције ових хормона у различитим ткивима и у различитим фазама развоја. Визуелизација деградације RGA-GFP фузије експримиране под дејством сопственог промотора пружа важне информације о регулацији укупних нивоа ГА у корену15,16. Међутим, експресија RGA варира у различитим ткивима17 и регулише је ГА18. Стога, диференцијална експресија RGA промотора може резултирати флуоресцентним обрасцем који се примећује код RGA-GFP и стога ова метода није квантитативна. Недавно је биоактивни флуоресцеин (Fl)-обележен ГА19,20 открио акумулацију ГА у ендокортексу корена и регулацију његових ћелијских нивоа транспортом ГА. Недавно је ГА FRET сензор nlsGPS1 показао да нивои ГА корелирају са издужењем ћелија у корену, филаментима и тамно узгајаним хипокотилима21. Међутим, као што смо видели, концентрација ГА није једини параметар који контролише активност ГА сигнализације, јер зависи од сложених процеса сензора. Овде, надограђујући се на наше разумевање ДЕЛЛА и ГА сигналних путева, извештавамо о развоју и карактеризацији рациометријског биосензора за ГА сигнализацију заснованог на деградацији. Да бисмо развили овај квантитативни биосензор, користили смо мутантни ГА-сензитивни RGA који је фузионисан са флуоресцентним протеином и свеприсутно експресован у ткивима, као и ГА-неосетљиви флуоресцентни протеин. Показујемо да фузије мутантних RGA протеина не ометају ендогену ГА сигнализацију када се свеприсутно експресују и да овај биосензор може квантификовати сигналну активност која је резултат и ГА улаза и обраде ГА сигнала од стране сензорског апарата са високом просторно-временском резолуцијом. Користили смо овај биосензор за мапирање просторно-временске дистрибуције ГА сигналне активности и квантификовање како ГА регулише ћелијско понашање у SAM епидермису. Показујемо да ГА регулише оријентацију равни деобе SAM ћелија које се налазе између органских зачетака, чиме дефинише канонску ћелијску организацију интернодија.
Коначно, питали смо се да ли qmRGA може да пријави промене у ендогеним нивоима GA користећи растуће хипокотиле. Претходно смо показали да нитрати стимулишу раст повећавањем синтезе GA и, заузврат, разградњом PERL34. Сходно томе, приметили смо да је дужина хипокотила код садница pUBQ10::qmRGA узгајаних под обилним снабдевањем нитратима (10 mM NO3−) била значајно дужа него код садница узгајаних у условима са недостатком нитрата (Допунска слика 6а). У складу са одговором раста, GA сигнали су били виши у хипокотилима садница узгајаних под условима 10 mM NO3− него код садница узгајаних у одсуству нитрата (Допунска слика 6б, ц). Дакле, qmRGA такође омогућава праћење промена у GA сигнализацији изазваних ендогеним променама у концентрацији GA.
Да бисмо разумели да ли ГА сигнална активност коју детектује qmRGA зависи од концентрације ГА и перцепције ГА, као што се и очекивало на основу дизајна сензора, анализирали смо експресију три GID1 рецептора у вегетативним и репродуктивним ткивима. Код садница, GID1-GUS репортерска линија је показала да су GID1a и c високо експресовани у котиледонима (Сл. 3a–c). Поред тога, сва три рецептора су експресована у листовима, бочним коренским зачецима, врховима корена (осим коренске капе GID1b) и васкуларном систему (Сл. 3a–c). У SAM цвасти, детектовали смо GUS сигнале само за GID1b и 1c (Допунска слика 7a–c). In situ хибридизација је потврдила ове обрасце експресије и додатно показала да је GID1c равномерно експресован на ниским нивоима у SAM, док је GID1b показао већу експресију на периферији SAM (Допунска слика 7d–l). Транслациона фузија pGID1b::2xmTQ2-GID1b такође је открила степеновани распон експресије GID1b, од ниске или никакве експресије у центру SAM до високе експресије на границама органа (Допунска слика 7м). Дакле, GID1 рецептори нису равномерно распоређени по ткивима и унутар њих. У каснијим експериментима, такође смо приметили да прекомерна експресија GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) повећава осетљивост qmRGA у хипокотилима на спољашњу примену GA (Слика 3д, е). Насупрот томе, флуоресценција мерена помоћу qd17mRGA у хипокотилу била је неосетљива на третман GA3 (Слика 3ф, г). За оба теста, саднице су третиране високим концентрацијама GA (100 μM GA3) да би се проценило брзо понашање сензора, где је способност везивања за GID1 рецептор била побољшана или изгубљена. Заједно, ови резултати потврђују да qmRGA биосензор служи комбинованој функцији као GA и GA сензор, и сугеришу да диференцијална експресија GID1 рецептора може значајно модулирати емисивност сензора.
До данас, дистрибуција ГА сигнала у САМ остаје нејасна. Стога смо користили биљке које експресују qmRGA и pCLV3::mCherry-NLS репортер матичних ћелија35 да бисмо израчунали квантитативне мапе ГА сигналне активности високе резолуције, фокусирајући се на L1 слој (епидермис; Сл. 4а, б, видети Методе и додатне методе), пошто L1 игра кључну улогу у контроли раста САМ36. Овде је експресија pCLV3::mCherry-NLS пружила фиксну геометријску референтну тачку за анализу просторно-временске дистрибуције ГА сигналне активности37. Иако се ГА сматра неопходним за развој латералних органа4, приметили смо да су ГА сигнали били ниски у цветном примордијуму (P) почевши од фазе P3 (Сл. 4а, б), док су млади P1 и P2 примордијуми имали умерену активност сличну оној у централном региону (Сл. 4а, б). Већа активност ГА сигнализације је откривена на границама примордија органа, почевши од П1/П2 (са стране границе) и достижући врхунац на П4, као и у свим ћелијама периферног региона који се налази између примордија (Сл. 4а, б и Допунска слика 8а, б). Ова већа активност ГА сигнализације је примећена не само у епидермису већ и у Л2 и горњим Л3 слојевима (Допунска слика 8б). Образац ГА сигнала откривених у САМ-у коришћењем qmRGA такође је остао непромењен током времена (Допунска слика 8ц–ф, к). Иако је конструкција qd17mRGA систематски смањена у САМ-у Т3 биљака из пет независних линија које смо детаљно окарактерисали, били смо у могућности да анализирамо флуоресцентне обрасце добијене конструкцијом pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Допунска слика 8г–ј, л). У овој контролној линији, откривене су само мање промене у односу флуоресценције у САМ-у, али у центру САМ-а смо приметили јасно и неочекивано смањење VENUS-а повезаног са TagBFP. Ово потврђује да сигнални образац који је приметио qmRGA одражава GA-зависну деградацију mRGA-VENUS, али такође показује да qmRGA може преценити GA сигналну активност у центру меристема. Укратко, наши резултати откривају GA сигнални образац који првенствено одражава дистрибуцију примордија. Ова дистрибуција интерпримордијалног региона (IPR) је последица постепеног успостављања високе GA сигналне активности између примордија у развоју и централног региона, док се истовремено GA сигнална активност у примордијалу смањује (Сл. 4ц, д).
Дистрибуција GID1b и GID1c рецептора (видети горе) сугерише да диференцијална експресија GA рецептора помаже у обликовању обрасца активности GA сигнализације у SAM. Питали смо се да ли би могла бити укључена диференцијална акумулација GA. Да бисмо истражили ову могућност, користили смо nlsGPS1 GA FRET сензор21. Повећана фреквенција активације је откривена у SAM-у nlsGPS1 третираног са 10 μM GA4+7 током 100 минута (Допунска слика 9a–e), што указује да nlsGPS1 реагује на промене концентрације GA у SAM-у, као што то чини у корену21. Просторна дистрибуција фреквенције активације nlsGPS1 открила је релативно ниске нивое GA у спољашњим слојевима SAM-а, али је показала да су повишени у центру и на ивицама SAM-а (Слика 4e и Допунска слика 9a,c). Ово сугерише да је GA такође дистрибуирана у SAM-у са просторним обрасцем упоредивим са оним који је открио qmRGA. Као комплементарни приступ, такође смо третирали SAM са флуоресцентним GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) или самим Fl као негативном контролом. Fl сигнал је био дистрибуиран по целом SAM-у, укључујући централни регион и примордијум, иако са нижим интензитетом (Сл. 4ј и Допунска слика 10д). Насупрот томе, сва три GA-Fl су се акумулирала специфично унутар граница примордијума и у различитом степену у остатку IPR-а, при чему се GA7-Fl акумулирао у највећем домену у IPR-у (Сл. 4к и Допунска слика 10а,б). Квантификација интензитета флуоресценције показала је да је однос интензитета IPR-а и не-IPR-а био већи код SAM-а третираног GA-Fl-ом у поређењу са SAM-ом третираним Fl-ом (Сл. 4л и Допунска слика 10ц). Заједно, ови резултати сугеришу да је GA присутан у вишим концентрацијама у IPR ћелијама које се налазе најближе граници органа. Ово сугерише да образац активности SAM GA сигнализације произилази и из диференцијалне експресије GA рецептора и из диференцијалне акумулације GA у IPR ћелијама близу граница органа. Дакле, наша анализа је открила неочекивани просторно-временски образац ГА сигнализације, са нижом активношћу у центру и примордијуму САМ и већом активношћу у ИПР у периферном региону.
Да бисмо разумели улогу диференцијалне ГА сигналне активности у SAM, анализирали смо корелацију између ГА сигналне активности, ширења ћелија и деобе ћелија користећи снимање у реалном времену са временским интервалом SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. С обзиром на улогу ГА у регулацији раста, очекивала се позитивна корелација са параметрима ширења ћелија. Стога смо прво упоредили мапе ГА сигналне активности са мапама брзине раста ћелијске површине (као замену за снагу ширења ћелија за дату ћелију и за ћерке ћелије при деоби) и са мапама анизотропије раста, која мери усмереност ширења ћелија (такође се овде користи за дату ћелију и за ћерке ћелије при деоби; Сл. 5а,б, видети Методе и додатне методе). Наше мапе брзине раста ћелијске површине SAM су у складу са претходним запажањима38,39, са минималним стопама раста на граници и максималним стопама раста у цветовима у развоју (Сл. 5а). Анализа главних компоненти (PCA) показала је да је ГА сигнална активност негативно корелирана са интензитетом раста ћелијске површине (Слика 5ц). Такође смо показали да су главне осе варијације, укључујући улаз ГА сигнализације и интензитет раста, биле ортогоналне на правац одређен високом експресијом CLV3, што потврђује искључивање ћелија из SAM центра у преосталим анализама. Спирманова корелациона анализа потврдила је резултате PCA (Слика 5д), указујући да виши ГА сигнали у IPR нису резултирали већом експанзијом ћелија. Међутим, корелациона анализа је открила благу позитивну корелацију између активности ГА сигнализације и анизотропије раста (Слика 5ц, д), што сугерише да виша ГА сигнализација у IPR утиче на правац раста ћелија и могуће положај равни ћелијске деобе.
а, б Топлотне мапе средњег површинског раста (а) и анизотропије раста (б) у SAM усредњене за седам независних биљака (коришћене као замена за јачину и смер ширења ћелија, респективно). ц PCA анализа је обухватила следеће варијабле: GA сигнал, интензитет површинског раста, анизотропију површинског раста и експресију CLV3. PCA компонента 1 је углавном негативно корелирала са интензитетом површинског раста и позитивно корелирала са GA сигналом. PCA компонента 2 је углавном позитивно корелирала са анизотропијом површинског раста и негативно корелирала са експресијом CLV3. Проценти представљају варијацију објашњену сваком компонентом. д Спирманова корелациона анализа између GA сигнала, интензитета површинског раста и анизотропије површинског раста на нивоу ткива, искључујући CZ. Број са десне стране је Спирманова rho вредност између две варијабле. Звездице означавају случајеве где је корелација/негативна корелација веома значајна. е 3Д визуелизација Col-0 SAM L1 ћелија конфокалном микроскопијом. Нови ћелијски зидови формирани у SAM (али не и у примордијуму) након 10 сати су обојени према њиховим угловима. Трака са бојама је приказана у доњем десном углу. Уметак приказује одговарајућу 3Д слику у 0 h. Експеримент је поновљен два пута са сличним резултатима. f Кутијасти дијаграми приказују брзине деобе ћелија у IPR и не-IPR Col-0 SAM (n = 10 независних биљака). Средишња линија приказује медијану, а границе кутије означавају 25. и 75. перцентил. Бркови означавају минималне и максималне вредности одређене помоћу R софтвера. P вредности су добијене Велчовим двостраним t-тестом. g, h Шематски дијаграм који приказује (g) како се мери угао новог ћелијског зида (магента) у односу на радијални правац од центра SAM-а (бела испрекидана линија) (узете у обзир само вредности оштрих углова, тј. 0–90°), и (h) циркумферентни/латерални и радијални правац унутар меристема. i Фреквентни хистограми оријентације равни деобе ћелија преко SAM-а (тамноплава), IPR (средње плава) и не-IPR (светлоплава), респективно. P вредности су добијене двостраним Колмогоров-Смирновљевим тестом. Експеримент је поновљен два пута са сличним резултатима. j Фреквентни хистограми оријентације равни ћелијске деобе IPR око P3 (светлозелена), P4 (средње зелена) и P5 (тамнозелена), респективно. P вредности су добијене двостраним Колмогоров-Смирновљевим тестом. Експеримент је поновљен два пута са сличним резултатима.
Стога смо затим истражили корелацију између ГА сигнализације и активности ћелијске деобе идентификовањем новоформираних ћелијских зидова током анализе (Сл. 5е). Овај приступ нам је омогућио да измеримо учесталост и смер ћелијске деобе. Изненађујуће, открили смо да је учесталост ћелијских деоба у IPR и остатку SAM (не-IPR, Сл. 5ф) била слична, што указује да разлике у ГА сигнализацији између IPR и не-IPR ћелија не утичу значајно на ћелијску деобу. Ово, и позитивна корелација између ГА сигнализације и анизотропије раста, подстакла нас је да размотримо да ли активност ГА сигнализације може утицати на оријентацију равни ћелијске деобе. Измерили смо оријентацију новог ћелијског зида као оштар угао у односу на радијалну осу која повезује центар меристема и центар новог ћелијског зида (Сл. 5е-и) и уочили јасну тенденцију ћелија да се деле под угловима близу 90° у односу на радијалну осу, са највишим фреквенцијама примећеним на 70–80° (23,28%) и 80–90° (22,62%) (Сл. 5е,и), што одговара ћелијским деобама у циркумферентном/попречном смеру (Сл. 5х). Да бисмо испитали допринос ГА сигнализације овом понашању ћелијске деобе, анализирали смо параметре ћелијске деобе у IPR и не-IPR одвојено (Сл. 5и). Уочили смо да се расподела углова деобе у IPR ћелијама разликује од оне у ћелијама које нису IPR или у ћелијама у целом SAM, при чему IPR ћелије показују већи удео латералних/кружних ћелијских деоба, тј. 70–80° и 80–90° (33,86% и 30,71%, респективно, одговарајуће пропорције) (Сл. 5и). Дакле, наша запажања су открила везу између високе GA сигнализације и оријентације равни ћелијске деобе близу циркумферентног правца, слично корелацији између активности GA сигнализације и анизотропије раста (Сл. 5ц, д). Да бисмо даље утврдили просторну конзервацију ове везе, мерили смо оријентацију равни деобе у IPR ћелијама које окружују примордијум почевши од P3, пошто је највећа активност GA сигнализације откривена у овом региону почевши од P4 (Сл. 4). Углови деобе IPR око P3 и P4 нису показали статистички значајне разлике, иако је повећана учесталост латералних ћелијских деоба примећена у IPR око P4 (Сл. 5ј). Међутим, у IPR ћелијама око P5, разлика у оријентацији равни ћелијске деобе постала је статистички значајна, са наглим повећањем учесталости попречних ћелијских деоба (Сл. 5ј). Заједно, ови резултати сугеришу да GA сигнализација може контролисати оријентацију ћелијских деоба у SAM, што је у складу са претходним извештајима40,41 да висока GA сигнализација може индуковати латералну оријентацију ћелијских деоба у IPR.
Предвиђа се да ћелије у IPR-у неће бити уграђене у примордије већ у интернодије2,42,43. Попречна оријентација ћелијских деоба у IPR-у може резултирати типичном организацијом паралелних уздужних редова епидермалних ћелија у интернодијима. Наша запажања описана горе сугеришу да GA сигнализација вероватно игра улогу у овом процесу регулисањем правца ћелијске деобе.
Губитак функције неколико ДЕЛЛА гена доводи до конститутивног ГА одговора, а дела мутанти се могу користити за тестирање ове хипотезе44. Прво смо анализирали обрасце експресије пет ДЕЛЛА гена у САМ-у. Транскрипциона фузија ГУС линије45 открила је да су ГАИ, РГА, РГЛ1 и РГЛ2 (у много мањој мери) експримирани у САМ-у (Допунска слика 11а–д). Ин ситу хибридизација је даље показала да се ГАИ мРНК акумулира специфично у примордијама и цветовима у развоју (Допунска слика 11е). РГЛ1 и РГЛ3 мРНК су детектоване широм крошње САМ-а и у старијим цветовима, док је РГЛ2 мРНК била заступљенија у граничном региону (Допунска слика 11ф–х). Конфокално снимање pRGL3::RGL3-GFP САМ потврдило је експресију примећену ин ситу хибридизацијом и показало да се РГЛ3 протеин акумулира у централном делу САМ-а (Допунска слика 11и). Користећи линију pRGA::GFP-RGA, такође смо открили да се RGA протеин акумулира у SAM, али се његова количина смањује на граници почевши од P4 (Допунска слика 11j). Приметно је да су обрасци експресије RGL3 и RGA у складу са већом активношћу GA сигнализације у IPR, што је детектовано помоћу qmRGA (Слика 4). Штавише, ови подаци указују на то да су сви ДЕЛА експресовани у SAM и да њихова експресија колективно обухвата цео SAM.
Затим смо анализирали параметре ћелијске деобе код дивљег типа SAM (Ler, контрола) и gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (глобални) мутанта (Сл. 6а, б). Занимљиво је да смо приметили статистички значајан помак у расподели фреквенција углова ћелијске деобе код della global мутанта SAM у поређењу са дивљим типом (Сл. 6ц). Ова промена код della global мутанта је последица повећања фреквенције углова од 80–90° (34,71% наспрам 24,55%) и, у мањој мери, углова од 70–80° (23,78% наспрам 20,18%), тј. што одговара попречним ћелијским деобама (Сл. 6ц). Учесталост непопречних ћелијских деоба (0–60°) је такође била нижа код della global мутанта (Сл. 6ц). Учесталост попречних ћелијских деоба је значајно повећана код SAM-а della global мутанта (Сл. 6б). Учесталост трансверзалних ћелијских деоба у IPR региону је такође била већа код della global мутанта у поређењу са дивљим типом (Сл. 6д). Ван IPR региона, дивљи тип је имао равномернију расподелу углова ћелијске деобе, док је della global мутант преферирао тангенцијалне деобе попут IPR региона (Сл. 6е). Такође смо квантификовали оријентацију ћелијских деоба у SAM петоструких мутаната ga2 оксидазе (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 и ga2ox6-2), GA-неактивне мутантске позадине у којој се GA акумулира. У складу са повећањем нивоа GA, SAM петоструког ga2ox мутантног цвасти био је већи од оног код Col-0 (додатна слика 12a, b), и у поређењу са Col-0, петоструки ga2ox SAM показао је изразито другачију расподелу углова ћелијске деобе, са фреквенцијом угла која се повећавала од 50° до 90°, тј. поново фаворизујући тангенцијалне деобе (додатна слика 12a–c). Дакле, показујемо да конститутивна активација GA сигнализације и акумулација GA индукују латералне ћелијске деобе у IPR и остатку SAM-а.
а, б 3Д визуелизација Л1 слоја ПИ-обојеног Лер (а) и глобалног дела мутанта (б) САМ коришћењем конфокалне микроскопије. Нови ћелијски зидови формирани у САМ-у (али не и у примордијуму) током периода од 10 сати су приказани и обојени према њиховим вредностима угла. Уметак приказује САМ у 0 сати. Трака боја је приказана у доњем десном углу. Стрелица у (б) показује на пример поравнатих ћелијских датотека у глобалном дела мутанту. Експеримент је поновљен два пута са сличним резултатима. цe поређење фреквентне расподеле оријентација равни ћелијске деобе у целом САМ-у (д), ИПР (е) и не-ИПР (ф) између Лер и глобалне дела. P вредности су добијене коришћењем двостраног Колмогоров-Смирновљевог теста. ф, г 3Д визуелизација конфокалних слика ПИ-обојеног САМ-а трансгених биљака Col-0 (и) и pCUC2::gai-1-VENUS (ј). Панели (а, б) приказују нове ћелијске зидове (али не и зачатке) формиране у SAM у року од 10 сати. Експеримент је поновљен два пута са сличним резултатима. h–j Поређење фреквентне расподеле оријентација равни ћелијске деобе које се налазе у целом SAM (h), IPR (i) и не-IPR (j) између биљака Col-0 и pCUC2::gai-1-VENUS. P вредности су добијене коришћењем двостраног Колмогоров-Смирновљевог теста.
Затим смо тестирали ефекат инхибиције ГА сигнализације специфично у IPR. У ту сврху, користили смо промотор котиледонске шољице 2 (CUC2) да бисмо покренули експресију доминантног негативног gai-1 протеина фузионог са VENUS (у линији pCUC2::gai-1-VENUS). Код дивљег типа SAM, CUC2 промотор покреће експресију већине IPR у SAM, укључујући граничне ћелије, од P4 па надаље, а слична специфична експресија је примећена код биљака pCUC2::gai-1-VENUS (видети доле). Дистрибуција углова ћелијске деобе преко SAM или IPR биљака pCUC2::gai-1-VENUS није се значајно разликовала од оне код дивљег типа, иако смо неочекивано открили да се ћелије без IPR у овим биљкама деле на вишој фреквенцији од 80–90° (Сл. 6f–j).
Сугерисано је да смер ћелијске деобе зависи од геометрије SAM-а, посебно од затезног напрезања генерисаног закривљеношћу ткива46. Стога смо питали да ли је облик SAM-а измењен код биљака della global мутанта и pCUC2::gai-1-VENUS. Као што је претходно објављено12, величина SAM-а della global мутанта била је већа него код дивљег типа (Допунска слика 13а, б, д). Ин ситу хибридизација CLV3 и STM РНК потврдила је ширење меристема код della мутаната и додатно показала латерално ширење нише матичних ћелија (Допунска слика 13е, ф, х, и). Међутим, закривљеност SAM-а била је слична код оба генотипа (Допунска слика 13к, м, н, п). Уочили смо слично повећање величине код gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della четвороструког мутанта без промене закривљености у поређењу са дивљим типом (Допунска слика 13ц, д, г, ј, л, о, п). Учесталост оријентације ћелијске деобе је такође била погођена код дела четвороструког мутанта, али у мањој мери него код дела монолитног мутанта (Допунска слика 12д–ф). Овај ефекат дозе, заједно са недостатком ефекта на закривљеност, сугерише да резидуална RGL3 активност код Дела четвороструког мутанта ограничава промене у оријентацији ћелијске деобе изазване губитком ДЕЛЛА активности и да се промене у латералним ћелијским деобама јављају као одговор на промене у ГА сигналној активности, а не на промене у геометрији САМ. Као што је горе описано, CUC2 промотор покреће експресију IPR у САМ почевши од П4 (Допунска слика 14а, б), и насупрот томе, pCUC2::gai-1-VENUS САМ је имао смањену величину, али већу закривљеност (Допунска слика 14ц–х). Ова промена у морфологији pCUC2::gai-1-VENUS САМ може резултирати другачијом расподелом механичких напона у поређењу са дивљим типом, код кога високи обимни напони почињу на краћој удаљености од центра САМ47. Алтернативно, промене у морфологији pCUC2::gai-1-VENUS SAM могу бити резултат промена у регионалним механичким својствима изазваним експресијом трансгена48. У оба случаја, ово би могло делимично да надокнади ефекте промена у GA сигнализацији повећавањем вероватноће да ће се ћелије делити у циркумферентној/попречној оријентацији, што објашњава наша запажања.
Узети заједно, наши подаци потврђују да виша ГА сигнализација игра активну улогу у латералној оријентацији равни ћелијске деобе у IPR-у. Такође показују да закривљеност меристема такође утиче на оријентацију равни ћелијске деобе у IPR-у.
Попречна оријентација равни деобе у IPR-у, због високе активности GA сигнализације, сугерише да GA претходно организује радијални ћелијски фасциклу у епидермису унутар SAM-а како би дефинисао ћелијску организацију која ће се касније наћи у епидермалном интернодију. Заиста, такве ћелијске фасцикле су често биле видљиве на SAM сликама della global мутаната (Сл. 6б). Стога, да бисмо даље истражили развојну функцију просторног обрасца GA сигнализације у SAM-у, користили смо снимање са убрзаним интервалом да бисмо анализирали просторну организацију ћелија у IPR-у код трансгених биљака дивљег типа (Ler и Col-0), della global мутаната и pCUC2::gai-1-VENUS.
Открили смо да qmRGA показује да се активност GA сигнализације у IPR повећава од P1/P2 и достиже врхунац на P4, и овај образац је остао константан током времена (Сл. 4a–f и Допунска слика 8c–f, k). Да бисмо анализирали просторну организацију ћелија у IPR са повећањем GA сигнала, означили смо Ler IPR ћелије изнад и са стране P4 према њиховој развојној судбини анализираној 34 сата након првог посматрања, тј. више од два пластидна времена, што нам је омогућило да пратимо IPR ћелије током развоја примордијума од P1/P2 до P4. Користили смо три различите боје: жуту за оне ћелије које су биле интегрисане у примордијум близу P4, зелену за оне које су биле у IPR и љубичасту за оне које су учествовале у оба процеса (Сл. 7a–c). У t0 (0 h), 1–2 слоја IPR ћелија била су видљива испред P4 (Сл. 7a). Као што се и очекивало, када су се ове ћелије поделиле, то су учиниле углавном преко попречне равни деобе (Сл. 7a–c). Слични резултати су добијени коришћењем Col-0 SAM (фокусирајући се на P3, чија се ивица савија слично као P4 код Ler-а), иако је код овог генотипа набор формиран на цветној ивици брже сакрио IPR ћелије (Сл. 7g–i). Дакле, образац деобе IPR ћелија претходно организује ћелије у радијалне редове, као код интернодија. Организација радијалних редова и локализација IPR ћелија између узастопних органа сугеришу да су ове ћелије интернодалне прогениторке.
Овде смо развили ратиометријски биосензор за ГА сигнализацију, qmRGA, који омогућава квантитативно мапирање активности ГА сигнализације која је резултат комбинованих концентрација ГА и ГА рецептора, уз минимизирање интерференције са ендогеним сигналним путевима, чиме се пружају информације о функцији ГА на ћелијском нивоу. У ту сврху, конструисали смо модификовани ДЕЛЛА протеин, mRGA, који је изгубио способност везивања за ДЕЛЛА интеракционе партнере, али остаје осетљив на протеолизу индуковану ГА. qmRGA реагује и на егзогене и на ендогене промене у нивоима ГА, а његова динамичка сензорска својства омогућавају процену просторно-временских промена у активности ГА сигнализације током развоја. qmRGA је такође веома флексибилан алат јер се може прилагодити различитим ткивима променом промотора који се користи за његову експресију (ако је потребно), а с обзиром на конзервирану природу пута ГА сигнализације и PFYRE мотива код ангиосперми, вероватно је да ће бити преносив на друге врсте22. У складу са овим, показало се да еквивалентна мутација у пиринчаном SLR1 ДЕЛЛА протеину (HYY497AAA) такође сузбија активност репресора раста SLR1, док само незнатно смањује његову GA-посредовану разградњу, слично mRGA23. Приметно је да су недавне студије на Arabidopsis показале да је једна аминокиселински мутација у PFYRE домену (S474L) променила транскрипциону активност RGA без утицаја на његову способност интеракције са партнерским транскрипционим факторима50. Иако је ова мутација веома блиска 3 супституције аминокиселина присутним у mRGA, наше студије показују да ове две мутације мењају различите карактеристике ДЕЛЛА. Иако се већина партнерских транскрипционих фактора везује за LHR1 и SAW домене ДЕЛЛА26,51, неке конзервиране аминокиселине у PFYRE домену могу помоћи у стабилизацији ових интеракција.
Развој интернодија је кључна особина у архитектури биљке и побољшању приноса. qmRGA је открио већу GA сигналну активност у IPR интернодијским ћелијама прогенитора. Комбиновањем квантитативног снимања и генетике, показали смо да GA сигнални обрасци суперпонирају кружне/попречне равни ћелијске деобе у SAM епидермису, обликујући организацију ћелијске деобе потребну за развој интернодија. Неколико регулатора оријентације равни ћелијске деобе идентификовано је током развоја52,53. Наш рад пружа јасан пример како GA сигнална активност регулише овај ћелијски параметар. може да интерагује са комплексима протеина пре савијања41, тако да GA сигнализација може регулисати оријентацију равни ћелијске деобе директним утицајем на оријентацију кортикалних микротубула40,41,54,55. Неочекивано смо показали да у SAM, корелат веће GA сигналне активности није издуживање или деоба ћелија, већ само анизотропија раста, што је у складу са директним ефектом GA на смер ћелијске деобе у IPR. Међутим, не можемо искључити да би овај ефекат могао бити и индиректан, на пример посредован GA-индукованим омекшавањем ћелијског зида56. Промене у својствима ћелијског зида изазивају механички стрес57,58, који такође може утицати на оријентацију равни ћелијске деобе утицајем на оријентацију кортикалних микротубула39,46,59. Комбиновани ефекти механичког стреса изазваног ГА и директне регулације оријентације микротубула помоћу ГА могу бити укључени у генерисање специфичног обрасца оријентације ћелијске деобе у ИПР како би се дефинисали интернодији, и потребна су даља истраживања како би се тестирала ова идеја. Слично томе, претходне студије су истакле важност протеина TCP14 и 15 који интерагују са ДЕЛЛА у контроли формирања интернодија60,61 и ови фактори могу посредовати у дејству ГА заједно са BREVIPEDICELLUS (BP) и PENNYWISE (PNY), који регулишу развој интернодија и за које је показано да утичу на ГА сигнализацију2,62. С обзиром на то да ДЕЛЛА интерагују са сигналним путевима брасиностероида, етилена, јасмонске киселине и апсцисинске киселине (АБА)63,64 и да ови хормони могу утицати на оријентацију микротубула65, ефекти ГА на оријентацију ћелијске деобе могу бити посредовани и другим хормонима.
Ране цитолошке студије су показале да су и унутрашњи и спољашњи региони Arabidopsis SAM неопходни за развој интернодија2,42. Чињеница да GA активно регулише деобу ћелија у унутрашњим ткивима12 подржава двоструку функцију GA у регулисању величине меристема и интернодија у SAM. Образац усмерене деобе ћелија је такође строго регулисан у унутрашњем ткиву SAM, и ова регулација је неопходна за раст стабла52. Биће занимљиво испитати да ли GA такође игра улогу у оријентацији равни ћелијске деобе у унутрашњој организацији SAM, чиме се синхронизује спецификација и развој интернодија унутар SAM.
Биљке су гајене in vitro у земљишту или 1x Murashige-Skoog (MS) медијуму (Duchefa) допуњеном са 1% сахарозе и 1% агара (Sigma) под стандардним условима (16 h светлости, 22 °C), осим за експерименте са хипокотилима и растом корена у којима су саднице гајене на вертикалним плочама под константном светлошћу и 22 °C. За експерименте са нитратима, биљке су гајене на модификованом MS медијуму (bioWORLD биљни медијум) допуњеном одговарајућим нитратом (0 или 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-сукцинатом, 1% сахарозом и 1% А-агаром (Sigma) под условима дугог дана.
GID1a кДНК уметнута у pDONR221 је рекомбинована са pDONR P4-P1R-pUBQ10 и pDONR P2R-P3-mCherry у pB7m34GW да би се генерисао pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 ДНК уметнута у pDONR221 је рекомбинована у pB7RWG266 да би се генерисао p35S:IDD2-RFP. Да би се генерисао pGID1b::2xmTQ2-GID1b, фрагмент од 3,9 kb узводно од GID1b кодирајућег региона и фрагмент од 4,7 kb који садржи GID1b cDNA (1,3 kb) и терминатор (3,4 kb) су прво амплификовани коришћењем прајмера у Додатној табели 3, а затим уметнути у pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) и pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), респективно, и коначно рекомбиновани са pDONR221 2xmTQ268 у циљни вектор pGreen 012567 коришћењем Gateway клонирања. Да би се генерисао pCUC2::LSSmOrange, промоторска секвенца CUC2 (3229 бп узводно од ATG), праћена кодирајућом секвенцом великог Стокес-помереног mOrange (LSSmOrange)69 са N7 сигналом нуклеарне локализације и NOS транскрипционим терминатором, састављене су у вектор за циљање канамицина pGreen коришћењем Gateway 3-фрагментног рекомбинационог система (Invitrogen). Биљни бинарни вектор је уведен у сој Agrobacterium tumefaciens GV3101 и уведен у листове Nicotiana benthamiana методом инфилтрације Agrobacterium и у Arabidopsis thaliana Col-0 методом флоралног потапања, респективно. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry и pCLV3::mCherry-NLS qmRGA су изоловани из F3 и F1 потомства одговарајућих укрштања, респективно.
РНК in situ хибридизација је извршена на врховима изданака дужине приближно 1 цм72, који су сакупљени и одмах фиксирани у раствору FAA (3,7% формалдехид, 5% сирћетна киселина, 50% етанол) претходно охлађеном на 4 °C. Након 2 × 15 минута вакуумског третмана, фиксатив је промењен и узорци су инкубирани преко ноћи. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 и RGL3 цДНК и антисенс сонде за њихове 3′-UTR су синтетизоване коришћењем прајмера приказаних у Додатној табели 3 као што је описано од стране Rosier et al.73. Дигоксигенином обележене сонде су имунотетковане коришћењем дигоксигенин антитела (3000-струко разблажење; Roche, каталошки број: 11 093 274 910), а пресеци су обојени раствором 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфата (BCIP, 250-струко разблажење)/нитроплавог тетразолијума (NBT, 200-струко разблажење).
Време објаве: 10. фебруар 2025.