Раст апикалног меристема (САМ) је критичан за архитектуру стабљике. Биљни хормонигиберелини(ГА) играју кључну улогу у координацији раста биљака, али њихова улога у САМ-у остаје слабо схваћена. Овде смо развили рациометријски биосензор ГА сигнализације тако што смо конструисали ДЕЛЛА протеин да потисне његову есенцијалну регулаторну функцију у транскрипционом одговору ГА, истовремено чувајући његову деградацију након препознавања ГА. Показали смо да овај биосензор заснован на деградацији тачно бележи промене у нивоима ГА и ћелијском сенсингу током развоја. Користили смо овај биосензор за мапирање сигналне активности ГА у САМ-у. Показали смо да су високи ГА сигнали присутни претежно у ћелијама које се налазе између примордија органа, који су прекурсори интернодијских ћелија. Користећи приступе добијања и губитка функције, ми даље показујемо да ГА регулише оријентацију равни ћелијске деобе, успостављајући канонску ћелијску организацију интернодија, чиме се промовише спецификација интернодија у САМ-у.
Апикални меристем изданака (САМ), који се налази на врху изданка, садржи нишу матичних ћелија чија активност генерише бочне органе и чворове стабљике на модуларан и итеративни начин током живота биљке. Свака од ових понављајућих јединица, или биљних чворова, укључује интернодије и бочне органе у чворовима, и аксиларне меристеме у пазуху листова1. Раст и организација биљних чворова се мења током развоја. Код Арабидопсис, интернодални раст је потиснут током вегетативне фазе, а аксиларни меристеми остају у мировању у пазуху листова розете. Током преласка у цветну фазу, САМ постаје меристем цвасти, стварајући издужене интернодије и пазушне пупољке, гранчице у пазуху листова бобица, а касније и цветове без листова2. Иако смо направили значајан напредак у разумевању механизама који контролишу покретање листова, цветова и грана, релативно мало се зна о томе како настају интернодије.
Разумевање просторно-временске дистрибуције ГА ће помоћи да се боље разумеју функције ових хормона у различитим ткивима и у различитим фазама развоја. Визуелизација деградације РГА-ГФП фузије изражене под дејством сопственог промотера даје важне информације о регулацији укупних нивоа ГА у коренима15,16. Међутим, експресија РГА варира у различитим ткивима17 и регулише је ГА18. Према томе, диференцијална експресија РГА промотера може резултирати узорком флуоресценције уоченим са РГА-ГФП и стога овај метод није квантитативан. Недавно је биоактивни флуоресцеин (Фл) обележен ГА19,20 открио акумулацију ГА у ендокортексу корена и регулацију његових ћелијских нивоа транспортом ГА. Недавно је ГА ФРЕТ сензор нлсГПС1 показао да нивои ГА корелирају са издужењем ћелија у коренима, филаментима и тамно израслим хипокотилима21. Међутим, као што смо видели, концентрација ГА није једини параметар који контролише активност сигнализације ГА, јер зависи од сложених процеса сенсинга. Овде, надовезујући се на наше разумевање ДЕЛЛА и ГА сигналних путева, извештавамо о развоју и карактеризацији рациометријског биосензора заснованог на деградацији за ГА сигнализацију. Да бисмо развили овај квантитативни биосензор, користили смо мутантни РГА осетљив на ГА који је фузионисан са флуоресцентним протеином и свеприсутно експримиран у ткивима, као и ГА-неосетљиви флуоресцентни протеин. Показали смо да мутантне РГА протеинске фузије не ометају ендогену ГА сигнализацију када је свеприсутно изражена, и да овај биосензор може квантификовати сигналну активност која је резултат и ГА улаза и обраде ГА сигнала од стране апарата за сенсинг са високом просторно-временском резолуцијом. Користили смо овај биосензор да мапирамо просторно-временску дистрибуцију сигналне активности ГА и квантификујемо како ГА регулише ћелијско понашање у САМ епидермису. Показали смо да ГА регулише оријентацију равни поделе САМ ћелија које се налазе између примордија органа, чиме се дефинише канонска ћелијска организација интернодија.
Коначно, питали смо да ли кмРГА може извести промене у ендогеним нивоима ГА користећи растуће хипокотиле. Раније смо показали да нитрат стимулише раст повећањем синтезе ГА и, заузврат, деградације ДЕЛЛА34. Сходно томе, приметили смо да је дужина хипокотила у пУБК10::кмРГА садницама узгојеним у обилном снабдевању нитратима (10 мМ НО3-) била значајно дужа од оне у садницама узгајаним у условима недостатка нитрата (додатна слика 6а). У складу са одговором на раст, ГА сигнали су били виши у хипокотилима садница узгајаних у условима од 10 мМ НО3- него у садницама које су узгајане у одсуству нитрата (додатна слика 6б, ц). Дакле, кмРГА такође омогућава праћење промена у сигнализацији ГА изазваних ендогеним променама концентрације ГА.
Да бисмо разумели да ли сигнална активност ГА коју детектује кмРГА зависи од концентрације ГА и перцепције ГА, као што се и очекивало на основу дизајна сензора, анализирали смо експресију три ГИД1 рецептора у вегетативним и репродуктивним ткивима. Код садница, репортерска линија ГИД1-ГУС показала је да су ГИД1а и ц високо изражени у котиледонима (сл. 3а–ц). Поред тога, сва три рецептора су била изражена у листовима, бочним примордијама корена, врховима корена (осим капице корена ГИД1б) и васкуларном систему (Слика 3а–ц). У САМ цвасти, открили смо ГУС сигнале само за ГИД1б и 1ц (додатна слика 7а-ц). Хибридизација ин ситу потврдила је ове обрасце експресије и даље показала да је ГИД1ц био униформно изражен на ниским нивоима у САМ-у, док је ГИД1б показао већу експресију на периферији САМ-а (додатна слика 7д-л). Транслациона фузија пГИД1б:: 2кмТК2-ГИД1б такође је открила степеновани опсег експресије ГИД1б, од ниске или никакве експресије у центру САМ до високе експресије на границама органа (додатна слика 7м). Дакле, ГИД1 рецептори нису равномерно распоређени по и унутар ткива. У наредним експериментима, такође смо приметили да прекомерна експресија ГИД1 (пУБК10::ГИД1а-мЦхерри) повећава осетљивост кмРГА у хипокотилима на спољну примену ГА (слика 3д, е). Насупрот томе, флуоресценција мерена помоћу кд17мРГА у хипокотилу била је неосетљива на третман ГА3 (слика 3ф, г). За оба теста, саднице су третиране високим концентрацијама ГА (100 μМ ГА3) да би се проценило брзо понашање сензора, где је способност везивања за ГИД1 рецептор побољшана или изгубљена. Заједно, ови резултати потврђују да кмРГА биосензор служи комбинованој функцији као ГА и ГА сензор, и сугеришу да диференцијална експресија ГИД1 рецептора може значајно модулирати емисивност сензора.
До данас, дистрибуција ГА сигнала у САМ-у остаје нејасна. Због тога смо користили биљке које експримирају кмРГА и пЦЛВ3::мЦхерри-НЛС репортер матичних ћелија35 да бисмо израчунали квантитативне мапе високе резолуције ГА сигналне активности, фокусирајући се на слој Л1 (епидермис; слика 4а, б, види Методе и додатне методе које С аАМ играју кључну улогу у контроли раста Л1). Овде је пЦЛВ3::мЦхерри-НЛС израз обезбедио фиксну геометријску референтну тачку за анализу просторно-временске дистрибуције ГА сигналне активности37. Иако се ГА сматра неопходним за развој бочних органа4, приметили смо да су сигнали ГА били ниски у цветном примордијуму (П) почевши од фазе П3 (слика 4а, б), док су млади примордијуми П1 и П2 имали умерену активност сличну оној у централном региону (слика 4а, б). Већа сигнална активност ГА је откривена на границама примордија органа, почевши од П1/П2 (на странама границе) и достижући врхунац на П4, као иу свим ћелијама периферног региона који се налази између примордија (сл. 4а, б и допунска слика 8а, б). Ова виша сигнална активност ГА примећена је не само у епидермису већ иу Л2 и горњим Л3 слојевима (додатна слика 8б). Образац ГА сигнала откривених у САМ-у помоћу кмРГА такође је остао непромењен током времена (додатна слика 8ц–ф, к). Иако је конструкт кд17мРГА систематски смањен у САМ биљака Т3 из пет независних линија које смо детаљно окарактерисали, били смо у могућности да анализирамо обрасце флуоресценције добијене са пРПС5а:: ВЕНУС-2А-ТагБФП конструктом (додатна слика 8г-ј, л). У овој контролној линији детектоване су само мање промене у односу флуоресценције у САМ-у, али у САМ центру смо приметили јасно и неочекивано смањење ВЕНУС-а повезаног са ТагБФП. Ово потврђује да образац сигнализације који посматра кмРГА одражава деградацију мРГА-ВЕНУС-а зависну од ГА, али такође показује да кмРГА може преценити активност сигнализације ГА у центру меристема. Укратко, наши резултати откривају образац ГА сигнализације који првенствено одражава дистрибуцију примордија. Оваква дистрибуција интер-примордијалног региона (ИПР) је последица постепеног успостављања високе сигналне активности ГА између примордијума у развоју и централног региона, док се истовремено ГА сигнална активност у примордијуму смањује (сл. 4ц, д).
Дистрибуција ГИД1б и ГИД1ц рецептора (види горе) сугерише да диференцијална експресија ГА рецептора помаже у обликовању обрасца сигналне активности ГА у САМ-у. Питали смо се да ли може бити укључена диференцијална акумулација ГА. Да бисмо истражили ову могућност, користили смо нлсГПС1 ГА ФРЕТ сензор21. Повећана фреквенција активације откривена је у САМ-у нлсГПС1 третираног са 10 μМ ГА4+7 током 100 минута (додатна слика 9а-е), што указује да нлсГПС1 реагује на промене у концентрацији ГА у САМ-у, као што је то случај у коренима21. Просторна дистрибуција фреквенције активације нлсГПС1 открила је релативно ниске нивое ГА у спољним слојевима САМ-а, али је показала да су они повишени у центру и на границама САМ-а (слика 4е и додатна слика 9а, ц). Ово сугерише да је ГА такође дистрибуиран у САМ-у са просторним обрасцем упоредивим са оним који је открио кмРГА. Као комплементарни приступ, такође смо третирали САМ са флуоресцентним ГА (ГА3-, ГА4-, ГА7-Фл) или самим Фл као негативном контролом. Фл сигнал је дистрибуиран по САМ-у, укључујући централни регион и примордијум, иако нижег интензитета (слика 4ј и додатна слика 10д). Насупрот томе, сва три ГА-Фл су се акумулирала посебно унутар граница примордијума и у различитом степену у остатку ИПР-а, при чему се ГА7-Фл акумулирао у највећем домену у ИПР-у (слика 4к и додатна слика 10а, б). Квантификација интензитета флуоресценције открила је да је однос интензитета ИПР и нон-ИПР био већи у САМ-у третираном ГА-Фл у поређењу са САМ-ом третираним Фл (слика 4л и додатна слика 10ц). Заједно, ови резултати сугеришу да је ГА присутан у вишим концентрацијама у ћелијама ИПР које се налазе најближе граници органа. Ово сугерише да је образац сигналне активности САМ ГА резултат и диференцијалне експресије ГА рецептора и диференцијалне акумулације ГА у ИПР ћелијама близу граница органа. Дакле, наша анализа је открила неочекивани просторно-временски образац ГА сигнализације, са нижом активношћу у центру и примордијуму САМ-а и већом активношћу у ИПР-у у периферном региону.
Да бисмо разумели улогу диференцијалне ГА сигналне активности у САМ-у, анализирали смо корелацију између сигналне активности ГА, проширења ћелије и ћелијске деобе користећи снимање у реалном времену с временским проласком САМ кмРГА пЦЛВ3::мЦхерри-НЛС. С обзиром на улогу ГА у регулацији раста, очекивала се позитивна корелација са параметрима експанзије ћелије. Због тога смо прво упоредили мапе активности сигнализације ГА са мапама брзине раста ћелијске површине (као проксија за снагу експанзије ћелије за дату ћелију и за ћерке ћелије при деоби) и са мапама анизотропије раста, која мери усмереност ширења ћелије (која се овде такође користи за дату ћелију и за ћерке ћелије при деоби; Додатак, види методу и методу б). Наше мапе брзине раста површине САМ ћелија су у складу са претходним запажањима38,39, са минималним стопама раста на граници и максималним стопама раста у цветовима у развоју (слика 5а). Анализа главних компоненти (ПЦА) је показала да је активност сигнализације ГА у негативној корелацији са интензитетом раста површине ћелије (Слика 5ц). Такође смо показали да су главне осе варијације, укључујући улаз сигнала ГА и интензитет раста, биле ортогоналне на смер који је одређен високом експресијом ЦЛВ3, потврђујући искључење ћелија из САМ центра у преосталим анализама. Спеарманова корелациона анализа потврдила је резултате ПЦА (слика 5д), што указује да виши ГА сигнали у ИПР-у нису довели до веће експанзије ћелије. Међутим, корелациона анализа је открила благу позитивну корелацију између сигналне активности ГА и анизотропије раста (слика 5ц, д), што сугерише да већа сигнализација ГА у ИПР утиче на смер раста ћелије и вероватно на положај равни ћелијске деобе.
а, б Топлотне мапе средњег површинског раста (а) и анизотропије раста (б) у САМ-у усредњене на седам независних биљака (користе се као замене за снагу и правац експанзије ћелије, респективно). ц ПЦА анализа је укључивала следеће варијабле: ГА сигнал, површински интензитет раста, анизотропију раста површине и експресију ЦЛВ3. ПЦА компонента 1 је углавном била у негативној корелацији са интензитетом површинског раста и у позитивној корелацији са ГА сигналом. ПЦА компонента 2 је углавном била у позитивној корелацији са анизотропијом раста површине и негативно са експресијом ЦЛВ3. Проценти представљају варијацију објашњену сваком компонентом. д Спеарманова анализа корелације између ГА сигнала, површинског интензитета раста и анизотропије површинског раста на скали ткива искључујући ЦЗ. Број са десне стране је Спеарманова рхо вредност између две променљиве. Звездице означавају случајеве где је корелација/негативна корелација веома значајна. 3Д визуализација Цол-0 САМ Л1 ћелија конфокалном микроскопијом. Нови ћелијски зидови формирани у САМ-у (али не и примордијум) у 10 х су обојени у складу са њиховим вредностима углова. Трака боја је приказана у доњем десном углу. Уметак приказује одговарајућу 3Д слику на 0 х. Експеримент је поновљен два пута са сличним резултатима. ф Оквирни графикони приказују стопе деобе ћелија у ИПР и нон-ИПР Цол-0 САМ (н = 10 независних биљака). Средишња линија показује медијану, а границе оквира означавају 25. и 75. перцентил. Бркови означавају минималне и максималне вредности одређене помоћу Р софтвера. П вредности су добијене Велчовим двостраним т-тестом. г, х Шематски дијаграм који показује (г) како се мери угао новог ћелијског зида (магента) у односу на радијални правац од центра САМ (бела тачкаста линија) (разматрају се само вредности акутног угла, тј. 0–90°), и (х) обимни/бочни и радијални правци. и Хистограми фреквенције оријентације равни ћелијске деобе преко САМ (тамно плава), ИПР (средње плава) и не-ИПР (светлоплава), респективно. П вредности су добијене двостраним Колмогоров-Смирнов тестом. Експеримент је поновљен два пута са сличним резултатима. ј Хистограми фреквенције оријентације равни ћелијске деобе ИПР-а око П3 (светло зелена), П4 (средње зелена) и П5 (тамно зелена), респективно. П вредности су добијене двостраним Колмогоров-Смирнов тестом. Експеримент је поновљен два пута са сличним резултатима.
Стога смо затим истражили корелацију између сигнализације ГА и активности ћелијске деобе идентификацијом новоформираних ћелијских зидова током теста (слика 5е). Овај приступ нам је омогућио да измеримо учесталост и смер ћелијске деобе. Изненађујуће, открили смо да је учесталост деоба ћелија у ИПР и остатку САМ-а (не-ИПР, слика 5ф) слична, што указује да разлике у ГА сигнализацији између ИПР и не-ИПР ћелија не утичу значајно на деобу ћелија. Ово, и позитивна корелација између ГА сигнализације и анизотропије раста, подстакли су нас да размотримо да ли активност сигнализације ГА може утицати на оријентацију равни ћелијске деобе. Измерили смо оријентацију новог ћелијског зида као оштар угао у односу на радијалну осу која повезује центар меристема и центар новог ћелијског зида (слика 5е-и) и приметили јасну тенденцију да се ћелије деле под угловима близу 90° у односу на радијалну осу, при чему су највеће фреквенције примећене на 70-80° (70-20%). 80–90° (22,62%) (слика 5е,и), што одговара деобама ћелија у ободном/попречном правцу (слика 5х). Да бисмо испитали допринос ГА сигнализације овом понашању ћелијске деобе, анализирали смо параметре ћелијске деобе у ИПР и не-ИПР одвојено (слика 5и). Приметили смо да се дистрибуција угла поделе у ИПР ћелијама разликовала од оне у ћелијама које нису ИПР или у ћелијама у целом САМ-у, при чему ИПР ћелије показују већи удео бочних/кружних деоба ћелија, тј. 70–80° и 80–90° (33,86% и 30,71%, пропорционално). Дакле, наша запажања су открила повезаност између високе ГА сигнализације и оријентације равни ћелијске деобе близу ободног правца, слично корелацији између сигналне активности ГА и анизотропије раста (слика 5ц, д). Да бисмо даље утврдили просторну конзервацију ове асоцијације, измерили смо оријентацију равни поделе у ИПР ћелијама које окружују примордијум почевши од П3, пошто је највећа активност ГА сигнала откривена у овом региону почевши од П4 (слика 4). Углови деобе ИПР око П3 и П4 нису показали статистички значајне разлике, иако је уочена повећана учесталост бочних деоба ћелија у ИПР око П4 (слика 5ј). Међутим, у ИПР ћелијама око П5, разлика у оријентацији равни ћелијске деобе постала је статистички значајна, са наглим повећањем учесталости попречних деоба ћелија (слика 5ј). Заједно, ови резултати сугеришу да ГА сигнализација може контролисати оријентацију ћелијских подела у САМ-у, што је у складу са претходним извештајима40,41 да висока ГА сигнализација може индуковати бочну оријентацију ћелијских деоба у ИПР.
Предвиђено је да ћелије у ИПР неће бити уграђене у примордија, већ у интерноде2,42,43. Попречна оријентација подела ћелија у ИПР-у може резултирати типичном организацијом паралелних уздужних редова епидермалних ћелија у интернодијама. Наша горе описана запажања сугеришу да ГА сигнализација вероватно игра улогу у овом процесу регулацијом правца ћелијске деобе.
Губитак функције неколико ДЕЛЛА гена доводи до конститутивног ГА одговора, а делла мутанти се могу користити за тестирање ове хипотезе44. Прво смо анализирали обрасце експресије пет ДЕЛЛА гена у САМ-у. Транскрипциона фузија ГУС линије45 открила је да су ГАИ, РГА, РГЛ1 и РГЛ2 (у много мањој мери) изражени у САМ-у (додатна слика 11а-д). Ин ситу хибридизација је даље показала да се ГАИ мРНА акумулира посебно у примордијама и цветовима у развоју (додатна слика 11е). РГЛ1 и РГЛ3 мРНА су откривене у целој САМ крошњи и у старијим цветовима, док је РГЛ2 мРНА била заступљенија у граничном региону (додатна слика 11ф-х). Конфокално снимање пРГЛ3 :: РГЛ3-ГФП САМ потврдило је експресију примећену хибридизацијом ин ситу и показало да се РГЛ3 протеин акумулира у централном делу САМ-а (додатна слика 11и). Користећи линију пРГА::ГФП-РГА, такође смо открили да се РГА протеин акумулира у САМ-у, али се његово обиље смањује на граници почевши од П4 (допунска слика 11ј). Значајно је да су обрасци експресије РГЛ3 и РГА у складу са вишом сигналном активношћу ГА у ИПР, као што је откривено помоћу кмРГА (слика 4). Штавише, ови подаци указују на то да су сви ДЕЛЛА изражени у САМ-у и да њихов израз колективно обухвата цео САМ.
Затим смо анализирали параметре ћелијске деобе у САМ-у дивљег типа (Лер, контрола) и гаи-т6 рга-т2 ргл1-1 ргл2-1 ргл3-4 делла петоструким (глобалним) мутантима (Слика 6а, б). Занимљиво је да смо приметили статистички значајну промену у дистрибуцији фреквенција угла деобе ћелија у делла глобалном мутантном САМ-у у поређењу са дивљим типом (слика 6ц). Ова промена у делла глобалном мутанту је настала услед повећања учесталости углова од 80–90° (34,71% наспрам 24,55%) и, у мањој мери, углова од 70–80° (23,78% наспрам 20,18%), односно, што одговара попречним деобама ћелија (слика 6ц). Учесталост нетрансверзалних подела (0–60°) је такође била нижа код делла глобалног мутанта (слика 6ц). Учесталост попречних деоба ћелија је значајно повећана у САМ делла глобалног мутанта (слика 6б). Учесталост попречних деоба ћелија у ИПР је такође била већа код делла глобалног мутанта у поређењу са дивљим типом (слика 6д). Изван ИПР региона, дивљи тип је имао равномернију дистрибуцију углова ћелијске деобе, док је делла глобални мутант преферирао тангенцијалне поделе попут ИПР (слика 6е). Такође смо квантификовали оријентацију ћелијских деоба у САМ-у петоструких мутаната га2 оксидазе (га2ок) (га2ок1-1, га2ок2-1, га2ок3-1, га2ок4-1 и га2ок6-2), ГА-неактивне мутантне позадине у којој се акумулира ГА. У складу са повећањем нивоа ГА, САМ петоструког га2ок мутантног цвасти био је већи од Цол-0 (допунска слика 12а, б), а у поређењу са Цол-0, петоструки га2ок САМ је показао изразито другачију дистрибуцију углова ћелијске деобе, са углом од 5° и поново повећањем фреквенције од 5° и. тангенцијалне поделе (допунска слика 12а–ц). Дакле, показујемо да конститутивна активација ГА сигнализације и акумулација ГА изазивају бочне ћелијске деобе у ИПР-у и остатку САМ-а.
а, б 3Д визуализација Л1 слоја ПИ обојеног Лер (а) и глобалног дела мутанта (б) САМ коришћењем конфокалне микроскопије. Нови ћелијски зидови формирани у САМ-у (али не и примордијуму) током периода од 10 сати су приказани и обојени према вредностима њихових углова. Уметак приказује САМ у 0 х. Трака боја је приказана у доњем десном углу. Стрелица у (б) показује на пример поравнатих датотека ћелија у глобалном делла мутанту. Експеримент је поновљен два пута са сличним резултатима. це поређење фреквенцијске дистрибуције оријентације равни ћелијске деобе у целом САМ (д), ИПР (е) и не-ИПР (ф) између Лер-а и глобалног дела. П вредности су добијене коришћењем двостраног Колмогоров-Смирнов теста. ф, г 3Д визуализација конфокалних слика ПИ обојених САМ трансгених биљака Цол-0 (и) и пЦУЦ2::гаи-1-ВЕНУС (ј). Панели (а, б) показују нове ћелијске зидове (али не и примордије) формиране у САМ-у у року од 10 х. Експеримент је поновљен два пута са сличним резултатима. х–ј Поређење фреквенцијске дистрибуције оријентација равни ћелијске деобе лоцираних у целом САМ (х), ИПР (и) и нон-ИПР (ј) између биљака Цол-0 и пЦУЦ2::гаи-1-ВЕНУС. П вредности су добијене коришћењем двостраног Колмогоров-Смирнов теста.
Затим смо тестирали ефекат инхибиције ГА сигнализације посебно у ИПР. У том циљу, користили смо промотор чашице котиледона 2 (ЦУЦ2) да покренемо експресију доминантног негативног гаи-1 протеина фузионисаног са ВЕНУС-ом (у пЦУЦ2::гаи-1-ВЕНУС линији). У САМ-у дивљег типа, ЦУЦ2 промотор покреће експресију већине ИПР-ова у САМ-у, укључујући граничне ћелије, од П4 па надаље, а слична специфична експресија је примећена у пЦУЦ2::гаи-1-ВЕНУС биљкама (види доле). Расподела углова ћелијске деобе преко САМ-а или ИПР биљака пЦУЦ2::гаи-1-ВЕНУС није се значајно разликовала од оне дивљег типа, иако смо неочекивано открили да су ћелије без ИПР-а у овим биљкама подељене на вишој фреквенцији од 80-90° (Слика 6ф-ј).
Предложено је да смер деобе ћелија зависи од геометрије САМ-а, посебно затезног напона изазваног закривљеношћу ткива46. Стога смо питали да ли је облик САМ-а промењен у делла глобалном мутанту и пЦУЦ2::гаи-1-ВЕНУС биљкама. Као што је раније објављено12, величина делла глобалног мутантног САМ-а била је већа од величине дивљег типа (додатна слика 13а, б, д). Ин ситу хибридизација ЦЛВ3 и СТМ РНК потврдила је експанзију меристема у делла мутантима и даље показала бочну експанзију нише матичних ћелија (додатна слика 13е, ф, х, и). Међутим, САМ закривљеност је била слична у оба генотипа (додатна слика 13к, м, н, п). Приметили смо слично повећање величине у четвороструком мутанту гаи-т6 рга-т2 ргл1-1 ргл2-1 делла без промене закривљености у поређењу са дивљим типом (допунска слика 13ц, д, г, ј, л, о, п). Учесталост оријентације ћелијске деобе је такође утицала на делла четвороструки мутант, али у мањој мери него код делла монолитног мутанта (додатна слика 12д-ф). Овај ефекат дозе, заједно са одсуством ефекта на закривљеност, сугерише да резидуална активност РГЛ3 у Делла четвороструком мутанту ограничава промене у оријентацији ћелијске деобе узроковане губитком ДЕЛЛА активности и да се промене у бочним деобама ћелија јављају као одговор на промене у сигналној активности ГА, а не на промене у геометрији САМ. Као што је горе описано, ЦУЦ2 промотор покреће експресију ИПР у САМ-у почевши од П4 (додатна слика 14а, б), а насупрот томе, пЦУЦ2 :: гаи-1-ВЕНУС САМ је имао смањену величину, али већу закривљеност (допунска слика 14ц-х). Ова промена у пЦУЦ2::гаи-1-ВЕНУС САМ морфологији може резултирати другачијом расподелом механичких напрезања у поређењу са дивљим типом, у коме високи обимни напони почињу на краћој удаљености од центра САМ47. Алтернативно, промене у морфологији пЦУЦ2::гаи-1-ВЕНУС САМ могу бити последица промена регионалних механичких својстава изазваних експресијом трансгена48. У оба случаја, ово би могло делимично да надокнади ефекте промена у ГА сигнализацији повећањем вероватноће да ће се ћелије поделити у ободној / попречној оријентацији, објашњавајући наша запажања.
Узети заједно, наши подаци потврђују да виша ГА сигнализација игра активну улогу у бочној оријентацији равни ћелијске поделе у ИПР. Они такође показују да закривљеност меристема такође утиче на оријентацију равни ћелијске деобе у ИПР.
Попречна оријентација равни поделе у ИПР-у, због високе сигналне активности ГА, сугерише да ГА унапред организује радијалну ћелијску датотеку у епидермису унутар САМ-а да дефинише ћелијску организацију која ће се касније наћи у епидермалној интернодији. Заиста, такве ћелијске датотеке су често биле видљиве на САМ сликама дела глобалних мутаната (слика 6б). Дакле, да бисмо даље истражили развојну функцију просторног обрасца ГА сигнализације у САМ-у, користили смо тиме-лапсе снимање да анализирамо просторну организацију ћелија у ИПР-у у дивљим типовима (Лер и Цол-0), делла глобалним мутантима и пЦУЦ2 :: гаи-1-ВЕНУС трансгеним биљкама.
Открили смо да је кмРГА показао да се активност сигнализације ГА у ИПР повећала са П1 / П2 и достигла врхунац на П4, а овај образац је остао константан током времена (сл. 4а-ф и додатна слика 8ц-ф, к). Да бисмо анализирали просторну организацију ћелија у ИПР са повећањем ГА сигнала, означили смо Лер ИПР ћелије изнад и са стране П4 према њиховој развојној судбини анализираној 34 сата након првог посматрања, односно више од два пута пластида, што нам омогућава да пратимо ИПР ћелије током развоја примордија од П1 / П2 до П4. Користили смо три различите боје: жуту за оне ћелије које су интегрисане у примордијум у близини П4, зелену за оне које су биле у ИПР и љубичасту за оне које су учествовале у оба процеса (сл. 7а–ц). У т0 (0 х), 1-2 слоја ИПР ћелија су били видљиви испред П4 (слика 7а). Као што се и очекивало, када су се ове ћелије поделиле, оне су то учиниле углавном преко попречне равни поделе (слике 7а–ц). Слични резултати су добијени коришћењем Цол-0 САМ (фокусирање на П3, чија се граница савија слично П4 код Лер), иако је у овом генотипу набор формиран на цветној граници брже сакрио ИПР ћелије (Слика 7г–и). Дакле, образац поделе ИПР ћелија унапред организује ћелије у радијалне редове, као у интернодијама. Организација радијалних редова и локализација ИПР ћелија између узастопних органа сугеришу да су ове ћелије интернодални прогенитори.
Овде смо развили рациометријски сигнални биосензор ГА, кмРГА, који омогућава квантитативно мапирање сигналне активности ГА која је резултат комбинованих концентрација ГА и ГА рецептора док минимизира сметње са ендогеним сигналним путевима, пружајући на тај начин информације о функцији ГА на ћелијском нивоу. У ту сврху, конструисали смо модификовани ДЕЛЛА протеин, мРГА, који је изгубио способност да веже ДЕЛЛА интеракцијске партнере, али остаје осетљив на протеолизу изазвану ГА. кмРГА реагује и на егзогене и на ендогене промене нивоа ГА, а његова динамичка својства сенсинга омогућавају процену просторно-временских промена у сигналној активности ГА током развоја. кмРГА је такође веома флексибилан алат јер се може прилагодити различитим ткивима променом промотера који се користи за његову експресију (ако је потребно), а с обзиром на очувану природу сигналног пута ГА и ПФИРЕ мотива преко критосемењача, вероватно ће бити преносив на друге врсте22. У складу са овим, показало се да еквивалентна мутација у СЛР1 ДЕЛЛА протеину пиринча (ХИИ497ААА) потискује активност репресора раста СЛР1 док само незнатно смањује његову деградацију посредовану ГА, слично мРГА23. Приметно је да су недавне студије у Арабидопсису показале да је једна мутација аминокиселине у домену ПФИРЕ (С474Л) променила транскрипциону активност РГА без утицаја на његову способност интеракције са партнерима транскрипционог фактора50. Иако је ова мутација веома блиска супституцијама од 3 аминокиселине присутне у мРГА, наше студије показују да ове две мутације мењају различите карактеристике ДЕЛЛА. Иако се већина партнера транскрипционог фактора везује за ЛХР1 и САВ домене ДЕЛЛА26,51, неке конзервиране аминокиселине у ПФИРЕ домену могу помоћи у стабилизацији ових интеракција.
Развој интернодија је кључна особина у архитектури биљака и побољшању приноса. кмРГА је открила већу сигналну активност ГА у ИПР интернодним прогениторским ћелијама. Комбиновањем квантитативног осликавања и генетике, показали смо да ГА сигнализацијски обрасци прекривају кружне/попречне равни ћелијске деобе у САМ епидермису, обликујући организацију ћелијске деобе потребну за развој интернодија. Током развоја идентификовано је неколико регулатора оријентације равни деобе ћелија52,53. Наш рад пружа јасан пример како ГА сигнална активност регулише овај ћелијски параметар. ДЕЛЛА може да ступи у интеракцију са комплексима протеина који се пре савијања41, тако да ГА сигнализација може регулисати оријентацију равни ћелијске деобе директним утицајем на оријентацију кортикалних микротубула40,41,54,55. Неочекивано смо показали да у САМ-у корелат веће сигналне активности ГА није издужење или деоба ћелије, већ само анизотропија раста, што је у складу са директним ефектом ГА на смер деобе ћелије у ИПР. Међутим, не можемо искључити да би овај ефекат могао бити и индиректан, на пример посредован омекшавањем ћелијског зида индукованог ГА56. Промене у својствима ћелијског зида изазивају механички стрес57,58, који такође може утицати на оријентацију равни ћелијске деобе утичући на оријентацију кортикалних микротубула39,46,59. Комбиновани ефекти механичког стреса изазваног ГА и директне регулације оријентације микротубула помоћу ГА могу бити укључени у генерисање специфичног обрасца оријентације ћелијске деобе у ИПР-у да би се дефинисале интерноде, и потребне су даље студије да би се тестирала ова идеја. Слично томе, претходне студије су истакле важност протеина ТЦП14 и 15 који делују на ДЕЛЛА у контроли формирања интернодија60,61 и ови фактори могу посредовати у деловању ГА заједно са БРЕВИПЕДИЦЕЛЛУС (БП) и ПЕННИВИСЕ (ПНИ), који регулишу развој интернодија и за које се показало да утичу на сигнал 62 ГА. С обзиром на то да ДЕЛЛА реагују са сигналним путевима брасиностероида, етилена, јасмонске киселине и апсцизинске киселине (АБА)63,64 и да ови хормони могу утицати на оријентацију микротубула65, ефекти ГА на оријентацију ћелијске деобе могу такође бити посредовани другим хормонима.
Ране цитолошке студије су показале да су и унутрашњи и спољашњи региони Арабидопсис САМ потребни за развој интернодије2,42. Чињеница да ГА активно регулише деобу ћелија у унутрашњим ткивима12 подржава двоструку функцију ГА у регулисању величине меристема и интернодије у САМ-у. Образац усмерене деобе ћелија је такође строго регулисан у унутрашњем САМ ткиву, а ова регулација је неопходна за раст стабла52. Биће занимљиво испитати да ли ГА такође игра улогу у оријентацији равни ћелијске поделе у унутрашњој САМ организацији, чиме се синхронизује спецификација и развој интернодија унутар САМ-а.
Биљке су гајене ин витро у земљишту или 1к Мурасхиге-Скоог (МС) медијуму (Дуцхефа) са додатком 1% сахарозе и 1% агара (Сигма) у стандардним условима (16 х светлост, 22 °Ц), осим експеримената раста хипокотила и корена у којима су саднице узгајане на константној светлости и вертикалним плочама 22 2 . За експерименте са нитратима, биљке су узгајане на модификованом МС медијуму (биљни медијум биоВОРЛД) са додатком адекватних нитрата (0 или 10 мМ КНО3), 0,5 мМ НХ4-сукцината, 1% сахарозе и 1% А-агара (Сигма) у условима дугог дана.
ГИД1а цДНК уметнута у пДОНР221 је рекомбинована са пДОНР П4-П1Р-пУБК10 и пДОНР П2Р-П3-мЦхерри у пБ7м34ГВ да би се генерисао пУБК10::ГИД1а-мЦхерри. ИДД2 ДНК уметнута у пДОНР221 је рекомбинована у пБ7РВГ266 да би се створио п35С:ИДД2-РФП. Да би се генерисао пГИД1б::2кмТК2-ГИД1б, фрагмент од 3,9 кб узводно од региона кодирања ГИД1б и фрагмент од 4,7 кб који садржи ГИД1б цДНК (1,3 кб) и терминатор (3,4 кб) су прво амплификовани коришћењем прајмера у додатној табели 3, а затим су уметнути прајмери у п ФиДОНР (П ФиДОНР). Сциентифиц) и пДОНР П2Р-П3 (Тхермо Фисхер Сциентифиц), респективно, и коначно рекомбинован са пДОНР221 2кмТК268 у пГреен 012567 циљни вектор коришћењем клонирања Гатеваи-а. Да би се генерисала пЦУЦ2::ЛССмОранге, секвенца промотора ЦУЦ2 (3229 бп узводно од АТГ) праћена секвенцом кодирања великог Стокесовог помереног мОранге (ЛССмОранге)69 са сигналом нуклеарне локализације Н7 и НОС транскрипционим терминатором су састављени у вектор пГреен канамицин-а који циља ре-Габин цом. (Инвитроген). Бинарни вектор биљке је уведен у Агробацтериум тумефациенс сој ГВ3101 и унесен у листове Ницотиана бентхамиана методом инфилтрације Агробацтериум и Арабидопсис тхалиана Цол-0 методом цветног умакања, респективно. пУБК10::кмРГА пУБК10::ГИД1а-мЦхерри и пЦЛВ3::мЦхерри-НЛС кмРГА су изоловани из Ф3 и Ф1 потомства одговарајућих укрштања.
Хибридизација РНК ин ситу је изведена на око 1 цм дугим врховима изданака72, који су сакупљени и одмах фиксирани у ФАА раствору (3,7% формалдехида, 5% сирћетне киселине, 50% етанола) претходно охлађеном на 4 °Ц. После 2 × 15 мин третмана вакуумом, фиксатор је промењен и узорци су инкубирани преко ноћи. ГИД1а, ГИД1б, ГИД1ц, ГАИ, РГЛ1, РГЛ2 и РГЛ3 цДНК и антисенс сонде за њихове 3′-УТР су синтетизоване коришћењем прајмера приказаних у Додатној табели 3 како су описали Росиер ет ал.73. Сонде обележене дигоксигенином су имунодетектоване коришћењем антитела на дигоксигенин (3000 пута разблажења; Роцхе, каталошки број: 11 093 274 910), а пресеци су обојени 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфатом) те БЦИП, дилу-2-2 (НБТ, 200-струко разблаживање) раствор.
Време поста: Феб-10-2025