Ова студија је проценила смртност, субсмртоносност и токсичност комерцијалнихциперметринформулације на пуноглавце ануранске. У акутном тесту, концентрације од 100–800 μг/Л су тестиране током 96 сати. У хроничном тесту, природно присутне концентрације циперметрина (1, 3, 6 и 20 μг/Л) су тестиране на морталитет, након чега је уследило тестирање микронуклеуса и нуклеарних абнормалности црвених крвних зрнаца током 7 дана. LC50 комерцијалне формулације циперметрина на пуноглавце била је 273,41 μг Л−1. У хроничном тесту, највиша концентрација (20 μг Л−1) резултирала је морталитетом већим од 50%, јер је убила половину тестираних пуноглаваца. Микронуклеус тест је показао значајне резултате на 6 и 20 μг Л−1 и откривено је неколико нуклеарних абнормалности, што указује да комерцијална формулација циперметрина има генотоксични потенцијал против P. gracilis. Циперметрин представља висок ризик за ову врсту, што указује да може изазвати вишеструке проблеме и утицати на динамику овог екосистема на краћи и дужи рок. Стога се може закључити да комерцијалне формулације циперметрина имају токсичне ефекте на P. gracilis.
Због континуираног ширења пољопривредних активности и интензивне применесузбијање штеточинамере, водене животиње су често изложене пестицидима1,2. Загађење водних ресурса у близини пољопривредних поља може утицати на развој и опстанак организама који нису циљани, као што су водоземци.
Водоземци постају све важнији у процени матрица животне средине. Анурани се сматрају добрим биоиндикаторима загађивача животне средине због својих јединствених карактеристика као што су сложени животни циклуси, брзе стопе раста ларви, трофички статус, пропусна кожа10,11, зависност од воде за размножавање12 и незаштићена јаја11,13,14. Мала водена жаба (Physalaemus gracilis), позната као плачућа жаба, показала се као биоиндикаторска врста загађења пестицидима4,5,6,7,15. Врста се налази у стајаћим водама, заштићеним подручјима или подручјима са променљивим стаништем у Аргентини, Уругвају, Парагвају и Бразилу1617 и сматра се стабилном према IUCN класификацији због своје широке распрострањености и толеранције на различита станишта18.
Сублетални ефекти су пријављени код водоземаца након излагања циперметрину, укључујући промене у понашању, морфолошке и биохемијске промене код пуноглаваца23,24,25, измењену смртност и време метаморфозе, ензимске промене, смањен успех излегања24,25, хиперактивност26, инхибицију активности холинестеразе27 и промене у перформансама пливања7,28. Међутим, студије генотоксичних ефеката циперметрина код водоземаца су ограничене. Стога је важно проценити осетљивост бескрајних врста на циперметрин.
Загађење животне средине утиче на нормалан раст и развој водоземаца, али најозбиљнији негативни ефекат је генетско оштећење ДНК изазвано излагањем пестицидима13. Анализа морфологије крвних зрнаца је важан биоиндикатор загађења и потенцијалне токсичности супстанце за дивље врсте29. Микронуклеус тест је једна од најчешће коришћених метода за одређивање генотоксичности хемикалија у животној средини30. То је брза, ефикасна и јефтина метода која је добар индикатор хемијског загађења организама као што су водоземци31,32 и може пружити информације о изложености генотоксичним загађивачима33.
Циљ ове студије био је да се процени токсични потенцијал комерцијалних формулација циперметрина на мале водене пуноглавце коришћењем микронуклеус теста и процене еколошког ризика.
Кумулативна смртност (%) пуноглаваца P. gracilis изложених различитим концентрацијама комерцијалног циперметрина током акутног периода теста.
Кумулативни морталитет (%) пуноглаваца P. gracilis изложених различитим концентрацијама комерцијалног циперметрина током хроничног теста.
Уочена висока смртност била је резултат генотоксичних ефеката код водоземаца изложених различитим концентрацијама циперметрина (6 и 20 μг/Л), што је доказано присуством микронуклеуса (МН) и нуклеарних абнормалности у еритроцитима. Формирање МН указује на грешке у митози и повезано је са лошим везивањем хромозома за микротубуле, дефектима у протеинским комплексима одговорним за усвајање и транспорт хромозома, грешкама у сегрегацији хромозома и грешкама у поправци оштећења ДНК38,39 и може бити повезано са оксидативним стресом изазваним пестицидима40,41. Друге абнормалности су примећене при свим процењеним концентрацијама. Повећање концентрација циперметрина повећало је нуклеарне абнормалности у еритроцитима за 5% и 20% при најнижим (1 μг/Л) и највишим (20 μг/Л) дозама, респективно. На пример, промене у ДНК врсте могу имати озбиљне последице по краткорочни и дугорочни опстанак, што резултира смањењем популације, измењеном репродуктивном способношћу, инбридингом, губитком генетске разноликости и измењеним стопама миграције. Сви ови фактори могу утицати на опстанак и одржавање врсте42,43. Формирање еритроидних абнормалности може указивати на блокаду цитокинезе, што доводи до абнормалне деобе ћелија (двојезгарни еритроцити)44,45; вишережњевита језгра су избочине нуклеарне мембране са више режњева46, док друге еритроидне абнормалности могу бити повезане са амплификацијом ДНК, као што су нуклеарни бубрези/мехурићи47. Присуство ануклеираних еритроцита може указивати на поремећен транспорт кисеоника, посебно у контаминираној води48,49. Апоптоза указује на ћелијску смрт50.
Друге студије су такође показале генотоксичне ефекте циперметрина. Кабања и др.51 показали су присуство микронуклеуса и нуклеарних промена као што су двоједарне ћелије и апоптотичке ћелије у ћелијама Odontophrynus americanus након излагања високим концентрацијама циперметрина (5000 и 10.000 μг L−1) током 96 сати. Апоптоза индукована циперметрином је такође откривена код P. biligonigerus52 и Rhinella arenarum53. Ови резултати указују на то да циперметрин има генотоксичне ефекте на низ водених организама и да MN и ENA тест може бити индикатор сублеталних ефеката на водоземце и да се може применити на домаће врсте и дивље популације изложене токсикантима12.
Комерцијалне формулације циперметрина представљају високу опасност по животну средину (и акутну и хроничну), при чему HQ прелазе ниво Агенције за заштиту животне средине САД (EPA)54, што може негативно утицати на врсту ако је присутна у животној средини. У процени хроничног ризика, NOEC за морталитет је био 3 μг L−1, што потврђује да концентрације пронађене у води могу представљати ризик за врсту55. Смртоносни NOEC за ларве R. arenarum изложене смеши ендосулфана и циперметрина био је 500 μг L−1 након 168 сати; ова вредност се смањила на 0,0005 μг L−1 након 336 сати. Аутори показују да што је дуже излагање, ниже су концентрације које су штетне за врсту. Такође је важно истаћи да су вредности NOEC биле веће од вредности P. gracilis у истом времену излагања, што указује да је одговор врсте на циперметрин специфичан за врсту. Штавише, у погледу морталитета, вредност CHQ код P. gracilis након излагања циперметрину достигла је 64,67, што је више од референтне вредности коју је поставила Агенција за заштиту животне средине САД54, а вредност CHQ код ларви R. arenarum такође је била виша од ове вредности (CHQ > 388,00 након 336 сати), што указује да проучавани инсектициди представљају висок ризик за неколико врста водоземаца. С обзиром на то да је P. gracilis потребно приближно 30 дана да заврши метаморфозу56, може се закључити да проучаване концентрације циперметрина могу допринети смањењу популације спречавајући заражене јединке да уђу у одраслу или репродуктивну фазу у раном добу.
У израчунатој процени ризика од микронуклеуса и других еритроцитних нуклеарних абнормалности, вредности CHQ су се кретале од 14,92 до 97,00, што указује да циперметрин има потенцијални генотоксични ризик за P. gracilis чак и у његовом природном станишту. Узимајући у обзир морталитет, максимална концентрација ксенобиотских једињења коју P. gracilis може толерисати била је 4,24 μг L−1. Међутим, концентрације ниске до 1 μг/L такође су показале генотоксичне ефекте. Ова чињеница може довести до повећања броја абнормалних јединки57 и утицати на развој и размножавање врста у њиховим стаништима, што доводи до смањења популација водоземаца.
Комерцијалне формулације инсектицида циперметрина показале су високу акутну и хроничну токсичност за P. gracilis. Примећене су веће стопе смртности, вероватно због токсичних ефеката, што је доказано присуством микронуклеуса и еритроцитних нуклеарних абнормалности, посебно назубљених језгара, режњевих језгара и везикуларних језгара. Поред тога, проучаване врсте су показале повећане ризике по животну средину, како акутне тако и хроничне. Ови подаци, у комбинацији са претходним студијама наше истраживачке групе, показали су да чак и различите комерцијалне формулације циперметрина и даље изазивају смањене активности ацетилхолинестеразе (AChE) и бутирилхолинестеразе (BChE) и оксидативни стрес58, и доводе до промена у активности пливања и оралних малформација59 код P. gracilis, што указује да комерцијалне формулације циперметрина имају високу леталну и сублеталну токсичност за ову врсту. Хартман и др.60 су открили да су комерцијалне формулације циперметрина биле најтоксичније за P. gracilis и другу врсту истог рода (P. cuvieri) у поређењу са девет других пестицида. Ово указује на то да законски одобрене концентрације циперметрина за заштиту животне средине могу довести до високе смртности и дугорочног смањења популације.
Потребна су даља истраживања како би се проценила токсичност пестицида за водоземце, јер концентрације пронађене у животној средини могу изазвати висок морталитет и представљати потенцијални ризик за P. gracilis. Треба подстицати истраживање врста водоземаца, јер су подаци о овим организмима оскудни, посебно о бразилским врстама.
Тест хроничне токсичности трајао је 168 сати (7 дана) под статичким условима, а сублеталне концентрације су биле: 1, 3, 6 и 20 μг аи Л−1. У оба експеримента, 10 пуноглаваца по третираној групи је процењено са шест понављања, за укупно 60 пуноглаваца по концентрацији. У међувремену, третман само водом служио је као негативна контрола. Свака експериментална поставка се састојала од стерилне стаклене посуде капацитета 500 мл и густине од 1 пуноглавца на 50 мл раствора. Боца је била прекривена полиетиленском фолијом да би се спречило испаравање и континуирано је аерирана.
Вода је хемијски анализирана да би се одредиле концентрације пестицида у 0, 96 и 168 сати. Према Сабину и др. 68 и Мартинсу и др. 69, анализе су спроведене у Лабораторији за анализу пестицида (LARP) Федералног универзитета Санта Марија коришћењем гасне хроматографије повезане са троструком квадруполном масеном спектрометријом (Varian model 1200, Пало Алто, Калифорнија, САД). Квантитативно одређивање пестицида у води је приказано као додатни материјал (Табела SM1).
За микронуклеус тест (MNT) и тест нуклеарних абнормалности црвених крвних зрнаца (RNA), анализирано је 15 пуноглаваца из сваке третиране групе. Пуноглавци су анестезирани са 5% лидокаином (50 мг г-170), а узорци крви су сакупљени срчаном пункцијом коришћењем шприцева за једнократну употребу са хепарином. Размази крви су припремљени на стерилним микроскопским плочицама, осушени на ваздуху, фиксирани са 100% метанолом (4 °C) током 2 минута, а затим обојени 10% Гимзиним раствором током 15 минута у мраку. На крају процеса, плочице су испране дестилованом водом да би се уклонио вишак боје и осушене на собној температури.
Најмање 1000 еритроцита из сваког пуноглавца анализирано је коришћењем микроскопа са увећањем од 100× и објективом од 71 како би се утврдило присуство MN и ENA. Укупно 75.796 еритроцита из пуноглавца процењено је узимајући у обзир концентрације циперметрина и контроле. Генотоксичност је анализирана према методи Караска и др. и Фенека и др.38,72 одређивањем учесталости следећих нуклеарних лезија: (1) ануклеарне ћелије: ћелије без језгара; (2) апоптотске ћелије: фрагментација једра, програмирана ћелијска смрт; (3) бинуклеарне ћелије: ћелије са два језгра; (4) нуклеарни пупољци или ћелије мехурића: ћелије са језгрима са малим избочинама нуклеарне мембране, мехурићи сличне величине микронуклеусима; (5) кариолизиране ћелије: ћелије само са обрисом језгра без унутрашњег материјала; (6) зарезне ћелије: ћелије са језгрима са очигледним пукотинама или зарезима у облику, такође назване језгра у облику бубрега; (7) лобулиране ћелије: ћелије са нуклеарним избочинама већим од горе поменутих везикула; и (8) микроћелије: ћелије са кондензованим једрима и смањеном цитоплазмом. Промене су упоређене са резултатима негативне контроле.
Резултати теста акутне токсичности (LC50) анализирани су коришћењем GBasic софтвера и TSK-Trimmed Spearman-Karber методе74. Подаци хроничног теста су претходно тестирани на нормалност грешке (Shapiro-Wilks) и хомогеност варијансе (Bartlett). Резултати су анализирани коришћењем једнофакторске анализе варијансе (ANOVA). Тјукијев тест је коришћен за поређење података међусобно, а Данетов тест је коришћен за поређење података између третиране групе и негативне контролне групе.
Подаци LOEC и NOEC су анализирани коришћењем Данетовог теста. Статистички тестови су спроведени коришћењем софтвера Statistica 8.0 (StatSoft) са нивоом значајности од 95% (p < 0,05).
Време објаве: 13. март 2025.