Ова студија је проценила смртност, сублеталитет и токсичност рекламациперметринформулације ануранским пуноглавцима. У акутном тесту, концентрације од 100–800 μг/Л су тестиране током 96 х. У хроничном тесту, природне концентрације циперметрина (1, 3, 6 и 20 μг/Л) су тестиране на морталитет, праћено микронуклеусним тестирањем и нуклеарним абнормалностима црвених крвних зрнаца током 7 дана. ЛЦ50 комерцијалне формулације циперметрина за пуноглавце био је 273,41 μг Л-1. У хроничном тесту, највећа концентрација (20 μг Л−1) је резултирала у морталитету већом од 50%, јер је убила половину тестираних пуноглаваца. Микронуклеус тест је показао значајне резултате при 6 и 20 μг Л-1 и откривено је неколико нуклеарних абнормалности, што указује да комерцијална формулација циперметрина има генотоксични потенцијал против П. грацилис. Циперметрин представља висок ризик за ову врсту, што указује да може изазвати вишеструке проблеме и утицати на динамику овог екосистема у кратком и дугорочном периоду. Стога се може закључити да комерцијалне формулације циперметрина имају токсичне ефекте на П. грацилис.
Због континуираног ширења пољопривредних делатности и интензивне примене вконтрола штеточинамере, водене животиње су често изложене пестицидима1,2. Загађење водних ресурса у близини пољопривредних поља може утицати на развој и опстанак нециљаних организама као што су водоземци.
Водоземци постају све важнији у процени еколошких матрица. Анурани се сматрају добрим биоиндикаторима загађивача животне средине због својих јединствених карактеристика као што су сложени животни циклуси, брзи раст ларви, трофички статус, пропусна кожа10,11, зависност од воде за репродукцију12 и незаштићена јаја11,13,14. Показало се да је мала водена жаба (Пхисалаемус грацилис), позната као жаба уплакана, биоиндикаторска врста загађења пестицидима4,5,6,7,15. Врста се налази у стајаћим водама, заштићеним подручјима или подручјима са променљивим стаништима у Аргентини, Уругвају, Парагвају и Бразилу1617 и сматра се стабилном према ИУЦН класификацији због своје широке распрострањености и толеранције на различита станишта18.
Сублетални ефекти су пријављени код водоземаца након излагања циперметрину, укључујући промене у понашању, морфолошке и биохемијске промене код пуноглаваца23,24,25, измењен морталитет и време метаморфозе, ензимске промене, смањен успех излегања24,25, хиперактивност26, инхибицију активности холинстеразе у пливању, промене у пливању27 и28. Међутим, студије генотоксичних ефеката циперметрина на водоземце су ограничене. Због тога је важно проценити осетљивост врста анура на циперметрин.
Загађење животне средине утиче на нормалан раст и развој водоземаца, али најозбиљнији негативан ефекат је генетско оштећење ДНК узроковано излагањем пестицидима13. Анализа морфологије крвних зрнаца је важан биоиндикатор загађења и потенцијалне токсичности неке супстанце за дивље врсте29. Микронуклеусни тест је једна од најчешће коришћених метода за одређивање генотоксичности хемикалија у животној средини30. То је брз, ефикасан и јефтин метод који је добар показатељ хемијског загађења организама као што су водоземци31,32 и може пружити информације о изложености генотоксичним загађивачима33.
Циљ ове студије је био да се процени токсични потенцијал комерцијалних формулација циперметрина за мале водене пуноглавце користећи микронуклеус тест и процену еколошког ризика.
Кумулативни морталитет (%) пуноглаваца П. грацилис изложених различитим концентрацијама комерцијалног циперметрина током акутног периода теста.
Кумулативни морталитет (%) пуноглаваца П. грацилис изложених различитим концентрацијама комерцијалног циперметрина током хроничног теста.
Уочени висок морталитет је резултат генотоксичних ефеката код водоземаца изложених различитим концентрацијама циперметрина (6 и 20 μг/Л), о чему сведочи присуство микронуклеуса (МН) и нуклеарних абнормалности у еритроцитима. Формирање МН указује на грешке у митози и повезано је са слабим везивањем хромозома за микротубуле, дефектима протеинских комплекса одговорних за унос и транспорт хромозома, грешкама у сегрегацији хромозома и грешкама у поправљању оштећења ДНК38,39 и може бити повезано са пестицидима изазваним оксидативним стресом,4040. Друге абнормалности су примећене при свим процењеним концентрацијама. Повећање концентрације циперметрина повећало је нуклеарне абнормалности у еритроцитима за 5% и 20% при најнижим (1 μг/Л) и највишим (20 μг/Л) дозама, респективно. На пример, промене у ДНК врсте могу имати озбиљне последице и на краткорочни и на дугорочни опстанак, што резултира опадањем популације, измењеном репродуктивном способности, инбреедингом, губитком генетске разноврсности и измењеним стопама миграције. Сви ови фактори могу утицати на опстанак и одржавање врста42,43. Формирање еритроидних абнормалности може указивати на блокаду цитокинезе, што резултира абнормалном деобом ћелија (бинуклеирани еритроцити)44,45; вишережна језгра су избочине нуклеарне мембране са вишеструким режњевима46, док друге абнормалности еритроида могу бити повезане са амплификацијом ДНК, као што су нуклеарни бубрези/мехурићи47. Присуство еритроцита без језгра може указивати на поремећен транспорт кисеоника, посебно у контаминираној води48,49. Апоптоза указује на смрт ћелије50.
Друге студије су такође показале генотоксичне ефекте циперметрина. Кабана и сарадници 51 су показали присуство микронуклеуса и нуклеарних промена као што су ћелије са бинуклеима и апоптотичке ћелије у ћелијама Одонтопхринус америцанус након излагања високим концентрацијама циперметрина (5000 и 10,000 μг Л-1) током 96 сати. Циперметрином индукована апоптоза је такође откривена код П. билигонигерус52 и Рхинелла аренарум53. Ови резултати сугеришу да циперметрин има генотоксичне ефекте на низ водених организама и да МН и ЕНА тест може бити индикатор сублеталних ефеката на водоземце и може бити применљив на аутохтоне врсте и дивље популације изложене токсичним материјама12.
Комерцијалне формулације циперметрина представљају високу опасност по животну средину (и акутну и хроничну), са штабовима који прелазе ниво америчке Агенције за заштиту животне средине (ЕПА)54, што може негативно утицати на врсту ако је присутна у животној средини. У процени хроничног ризика, НОЕЦ за морталитет је био 3 μг Л−1, што потврђује да концентрације пронађене у води могу представљати ризик за врсту55. Смртоносни НОЕЦ за ларве Р. аренарум изложене мешавини ендосулфана и циперметрина био је 500 μг Л-1 након 168 х; ова вредност се смањила на 0,0005 μг Л−1 после 336 х. Аутори показују да што је дуже излагање, то су ниже концентрације које су штетне за врсту. Такође је важно истаћи да су вредности НОЕЦ биле веће од вредности П. грацилис у исто време излагања, што указује да је одговор врсте на циперметрин специфичан за врсту. Штавише, у погледу морталитета, ЦХК вредност П. грацилис након излагања циперметрину достигла је 64,67, што је више од референтне вредности коју је одредила Агенција за заштиту животне средине САД54, а ЦХК вредност ларви Р. аренарум је такође била виша од ове вредности (ЦХК > 388,00 х) који представља висок ризик након 3333. на неколико врста водоземаца. С обзиром на то да је П. грацилис потребно око 30 дана да заврши метаморфозу56, може се закључити да проучаване концентрације циперметрина могу допринети смањењу популације спречавањем инфицираних особа да уђу у одраслу или репродуктивну фазу у раном узрасту.
У израчунатој процени ризика од микронуклеуса и других нуклеарних абнормалности еритроцита, вредности ЦХК су се кретале од 14,92 до 97,00, што указује да циперметрин има потенцијални генотоксични ризик за П. грацилис чак иу свом природном станишту. Узимајући у обзир морталитет, максимална концентрација ксенобиотских једињења подношљивих за П. грацилис била је 4,24 μг Л−1. Међутим, концентрације од само 1 μг/Л такође су показале генотоксичне ефекте. Ова чињеница може довести до повећања броја абнормалних јединки57 и утицати на развој и репродукцију врста у њиховим стаништима, што доводи до смањења популација водоземаца.
Комерцијалне формулације инсектицида циперметрина показале су високу акутну и хроничну токсичност за П. грацилис. Уочене су веће стопе морталитета, вероватно због токсичних ефеката, о чему сведочи присуство микронуклеуса и нуклеарних абнормалности еритроцита, посебно назубљених језгара, језгара са режњевима и везикуларних језгара. Поред тога, проучаване врсте су показале повећане еколошке ризике, и акутне и хроничне. Ови подаци, у комбинацији са претходним студијама наше истраживачке групе, показали су да чак и различите комерцијалне формулације циперметрина и даље изазивају смањене активности ацетилхолинестеразе (АЦхЕ) и бутирилхолинестеразе (БЦхЕ) и оксидативног стреса58, и резултирају променама активности пливања и оралним малформацијама59 у П. грацилис формулацијама, што указује да имају високу комерцијалну субтоксичност летхалпермета и оксидативних формула. ова врста. Хартманн ет ал. 60 су открили да су комерцијалне формулације циперметрина најтоксичније за П. грацилис и другу врсту истог рода (П. цувиери) у поређењу са девет других пестицида. Ово сугерише да законом одобрене концентрације циперметрина за заштиту животне средине могу довести до високог морталитета и дугорочног опадања популације.
Потребне су даље студије да би се проценила токсичност пестицида за водоземце, пошто концентрације пронађене у животној средини могу изазвати висок морталитет и представљати потенцијални ризик за П. грацилис. Треба подстицати истраживања о врстама водоземаца, јер су подаци о овим организмима оскудни, посебно о бразилским врстама.
Тест хроничне токсичности је трајао 168 х (7 дана) у статичким условима, а сублеталне концентрације су биле: 1, 3, 6 и 20 μг аи Л−1. У оба експеримента, 10 пуноглаваца по групи третмана је процењено са шест понављања, за укупно 60 пуноглаваца по концентрацији. У међувремену, третман само водом је послужио као негативна контрола. Свака експериментална поставка састојала се од стерилне стаклене посуде капацитета 500 мл и густине 1 пуноглавац на 50 мл раствора. Балон је прекривен полиетиленском фолијом да би се спречило испаравање и непрекидно је проветраван.
Вода је хемијски анализирана да би се одредиле концентрације пестицида на 0, 96 и 168 х. Према Сабину и др. 68 и Мартинс ет ал. 69, анализе су обављене у Лабораторији за анализу пестицида (ЛАРП) Федералног универзитета Санта Мариа коришћењем гасне хроматографије спрегнуте са троструком квадруполном масеном спектрометријом (Вариан модел 1200, Пало Алто, Калифорнија, САД). Квантитативно одређивање пестицида у води приказано је као допунски материјал (Табела СМ1).
За микронуклеусни тест (МНТ) и тест нуклеарне абнормалности црвених крвних зрнаца (РНА), анализирано је 15 пуноглаваца из сваке третиране групе. Пуноглавци су анестезирани са 5% лидокаина (50 мг г-170) и узорци крви су сакупљени срчаном пункцијом коришћењем хепаринизованих шприцева за једнократну употребу. Размази крви су припремљени на стерилним микроскопским предметима, осушени на ваздуху, фиксирани са 100% метанолом (4 °Ц) током 2 мин, а затим обојени 10% Гиемса раствором 15 минута у мраку. На крају процеса, предмети су испрани дестилованом водом да би се уклонио вишак мрља и осушени на собној температури.
Најмање 1000 еритроцита из сваког пуноглавца анализирано је коришћењем микроскопа од 100× са циљем 71 да би се утврдило присуство МН и ЕНА. Укупно 75.796 еритроцита пуноглаваца је процењено с обзиром на концентрације и контроле циперметрина. Генотоксичност је анализирана према методи Царрасцо ет ал. и Фенецх ет ал.38,72 одређивањем учесталости следећих нуклеарних лезија: (1) ћелије без језгра: ћелије без језгра; (2) апоптотичке ћелије: нуклеарна фрагментација, програмирана ћелијска смрт; (3) двонуклеарне ћелије: ћелије са два језгра; (4) нуклеарни пупољци или ћелије мехурића: ћелије са језгром са малим избочинама језгрене мембране, мехуриће сличне величине микронуклеусима; (5) кариолизоване ћелије: ћелије са само обрисом језгра без унутрашњег материјала; (6) зарезане ћелије: ћелије са језгром са очигледним пукотинама или зарезима у њиховом облику, које се називају и језгра у облику бубрега; (7) лобуларне ћелије: ћелије са нуклеарним избочинама већим од горе поменутих везикула; и (8) микроћелије: ћелије са кондензованим језгрима и смањеном цитоплазмом. Промене су упоређене са резултатима негативне контроле.
Резултати теста акутне токсичности (ЛЦ50) су анализирани коришћењем ГБасиц софтвера и ТСК-Триммед Спеарман-Карбер методе74. Подаци хроничног теста су претходно тестирани на нормалност грешке (Схапиро-Вилкс) и хомогеност варијансе (Бартлетт). Резултати су анализирани коришћењем једносмерне анализе варијансе (АНОВА). Тукијев тест је коришћен за упоређивање података међу њима, а Данетов тест је коришћен за упоређивање података између третиране групе и групе негативне контроле.
Подаци о ЛОЕЦ и НОЕЦ анализирани су коришћењем Дунетт-овог теста. Статистички тестови су обављени коришћењем софтвера Статистица 8.0 (СтатСофт) са нивоом значајности од 95% (п < 0,05).
Време поста: 13. март 2025