Широко распрострањена употреба синтетичких пестицида довела је до многих проблема, укључујући појаву отпорних организама, деградацију животне средине и штету по људско здравље. Стога, нови микробнипестицидиХитно су потребни препарати који су безбедни за људско здравље и животну средину. У овој студији, рамнолипидни биосурфактант који производи Enterobacter cloacae SJ2 коришћен је за процену токсичности за ларве комараца (Culex quinquefasciatus) и термита (Odontotermes obesus). Резултати су показали да је постојала стопа смртности зависна од дозе између третмана. Вредност LC50 (50% смртоносна концентрација) након 48 сати за биосурфактанте термита и ларви комараца одређена је методом нелинеарне регресионе криве. Резултати су показали да су вредности LC50 након 48 сати (95% интервал поверења) ларвицидне и антитермитске активности биосурфактанта биле 26,49 мг/Л (опсег од 25,40 до 27,57) и 33,43 мг/Л (опсег од 31,09 до 35,68), респективно. Према хистопатолошком прегледу, третман биосурфактантима изазвао је озбиљно оштећење органелних ткива ларви и термита. Резултати ове студије указују да је микробни биосурфактант који производи Enterobacter cloacae SJ2 одлично и потенцијално ефикасно средство за контролу Cx, quinquefasciatus и O. obesus.
Тропске земље доживљавају велики број болести које преносе комарци1. Релевантност болести које преносе комарци је широко распрострањена. Више од 400.000 људи умре од маларије сваке године, а неки већи градови доживљавају епидемије озбиљних болести као што су денга, жута грозница, чикунгуња и Зика.2 Векторске болести повезане су са једном од шест инфекција широм света, при чему комарци узрокују најзначајније случајеве3,4. Culex, Anopheles и Aedes су три рода комараца која се најчешће повезују са преношењем болести5. Преваленција денга грознице, инфекције коју преноси комарац Aedes aegypti, повећала се у последњој деценији и представља значајну претњу по јавно здравље4,7,8. Према Светској здравственој организацији (СЗО), више од 40% светске популације је у ризику од денга грознице, са 50–100 милиона нових случајева који се јављају годишње у више од 100 земаља9,10,11. Денга грозница је постала велики проблем јавног здравља јер се њена инциденца повећала широм света12,13,14. Anopheles gambiae, познатији као афрички комарац Anopheles, најважнији је вектор људске маларије у тропским и суптропским регионима15. Вирус Западног Нила, енцефалитис Сент Луиса, јапански енцефалитис и вирусне инфекције коња и птица преносе комарци Culex, често називани кућни комарци. Поред тога, они су такође преносиоци бактеријских и паразитских болести16. У свету постоји више од 3.000 врста термита, а постоје више од 150 милиона година17. Већина штеточина живи у земљишту и храни се дрветом и производима од дрвета који садрже целулозу. Индијски термит Odontotermes obesus је важна штеточина која узрокује озбиљну штету важним усевима и дрвећу на плантажама18. У пољопривредним подручјима, заразе термитима у различитим фазама могу проузроковати огромну економску штету различитим усевима, врстама дрвећа и грађевинским материјалима. Термити такође могу изазвати проблеме са људским здрављем19.
Питање отпорности микроорганизама и штеточина у данашњим фармацеутским и пољопривредним областима је сложено20,21. Стога, обе компаније треба да траже нове исплативе антимикробне лекове и безбедне биопестициде. Синтетички пестициди су сада доступни и показало се да су заразни и да одбијају корисне инсекте који нису циљани22. Последњих година, истраживања биосурфактаната су се проширила због њихове примене у различитим индустријама. Биосурфактанци су веома корисни и витални у пољопривреди, ремедијацији земљишта, екстракцији нафте, уклањању бактерија и инсеката и преради хране23,24. Биосурфактанти или микробни сурфактанти су биосурфактантне хемикалије које производе микроорганизми као што су бактерије, квасци и гљивице у приобалним стаништима и подручјима контаминираним нафтом25,26. Хемијски изведени сурфактанти и биосурфактанти су две врсте које се добијају директно из природног окружења27. Различити биосурфактанти се добијају из морских станишта28,29. Стога, научници траже нове технологије за производњу биосурфактаната на бази природних бактерија30,31. Напредак у таквим истраживањима показује важност ових биолошких једињења за заштиту животне средине32. Bacillus, Pseudomonas, Rhodococcus, Alcaligenes, Corynebacterium и ови бактеријски родови су добро проучени представници23,33.
Постоји много врста биосурфактаната са широким спектром примене34. Значајна предност ових једињења је у томе што нека од њих имају антибактеријско, ларвицидно и инсектицидно дејство. То значи да се могу користити у пољопривредној, хемијској, фармацеутској и козметичкој индустрији35,36,37,38. Пошто су биосурфактани генерално биоразградиви и еколошки корисни, користе се у интегрисаним програмима сузбијања штеточина ради заштите усева39. Стога су добијена основна знања о ларвицидном и антитермитском дејству микробних биосурфактаната које производи Enterobacter cloacae SJ2. Испитали смо морталитет и хистолошке промене када су изложени различитим концентрацијама рамнолипидних биосурфактаната. Поред тога, проценили смо широко коришћени компјутерски програм за квантитативну структуру-активност (QSAR) под називом Еколошка структура-активност (ECOSAR) како бисмо одредили акутну токсичност за микроалге, дафније и рибе.
У овој студији, тестирана је антитермитска активност (токсичност) пречишћених биосурфактаната у различитим концентрацијама у распону од 30 до 50 мг/мл (у интервалима од 5 мг/мл) против индијских термита, O. obesus и четврте врсте. (Процена. Ларве инстара Cx. Ларве комараца quinquefasciatus. Концентрације LC50 биосурфактаната током 48 сати против O. obesus и Cx. C. solanacearum. Ларве комараца су идентификоване коришћењем методе нелинеарне регресионе криве. Резултати су показали да се морталитет термита повећава са повећањем концентрације биосурфактаната. Резултати су показали да биосурфактант има ларвицидно дејство (Слика 1) и антитермитско дејство (Слика 2), са вредностима LC50 после 48 сати (95% CI) од 26,49 мг/л (25,40 до 27,57) и 33,43 мг/л (Слика 31,09 до 35,68), респективно (Табела 1). У погледу акутне токсичности (48 сати), биосурфактант је класификован као „штетан“ за тестиране организме. Биосурфактант произведен у овој студији показао је одлично ларвицидно дејство са 100% морталитетом у року од 24-48 сати од излагања.
Израчунајте вредност LC50 за ларвицидну активност. Уклапање криве нелинеарне регресије (пуна линија) и 95% интервал поверења (осенчена површина) за релативни морталитет (%).
Израчунајте вредност LC50 за антитермитску активност. Уклапање криве нелинеарне регресије (пуна линија) и интервал поверења од 95% (осенчена површина) за релативни морталитет (%).
На крају експеримента, морфолошке промене и аномалије су примећене под микроскопом. Морфолошке промене су примећене у контролној и третираној групи при увећању од 40 пута. Као што је приказано на слици 3, оштећење раста се јавило код већине ларви третираних биосурфактантима. Слика 3а приказује нормалан Cx. quinquefasciatus, слика 3б приказује аномални Cx. Узрокује пет ларви нематода.
Утицај сублеталних (LC50) доза биосурфактаната на развој ларви Culex quinquefasciatus. Слика светлосне микроскопије (а) нормалног Cx при увећању од 40×. quinquefasciatus (б) Абнормални Cx. Узрокује пет ларви нематода.
У овој студији, хистолошки преглед третираних ларви (Сл. 4) и термита (Сл. 5) открио је неколико абнормалности, укључујући смањење површине абдомена и оштећење мишића, епителних слојева и коже средњег црева. Хистологија је открила механизам инхибиторне активности биосурфактанта коришћеног у овој студији.
Хистопатологија нормалних нетретираних ларви Cx четвртог инстара. Ларве quinquefasciatus (контрола: (а, б)) и третиране биосурфактантом (третман: (ц, д)). Стрелице означавају третирани цревни епител (epi), језгра (n) и мишић (mu). Црта = 50 µm.
Хистопатологија нормалног нетретираног O. obesus (контрола: (а, б)) и третираног биосурфактантом (третман: (ц, д)). Стрелице означавају цревни епител (епи) и мишић (му), респективно. Црта = 50 µм.
У овој студији, ECOSAR је коришћен за предвиђање акутне токсичности рамнолипидних биосурфактантних производа за примарне произвођаче (зелене алге), примарне потрошаче (водене буве) и секундарне потрошаче (рибе). Овај програм користи софистициране квантитативне моделе структуре и активности једињења за процену токсичности на основу молекуларне структуре. Модел користи софтвер структуре и активности (SAR) за израчунавање акутне и дугорочне токсичности супстанци за водене врсте. Конкретно, Табела 2 сумира процењене средње смртоносне концентрације (LC50) и средње ефективне концентрације (EC50) за неколико врста. Сумња на токсичност је категорисана у четири нивоа користећи Глобално хармонизовани систем класификације и обележавања хемикалија (Табела 3).
Сузбијање болести које преносе вектори, посебно сојева комараца и комараца врсте Aedes. Египћани сада теже раде 40,41,42,43,44,45,46. Иако су неки хемијски доступни пестициди, попут пиретроида и органофосфата, донекле корисни, они представљају значајан ризик по људско здравље, укључујући дијабетес, репродуктивне поремећаје, неуролошке поремећаје, рак и респираторне болести. Штавише, временом, ови инсекти могу постати отпорни на њих13,43,48. Стога ће ефикасне и еколошки прихватљиве биолошке мере сузбијања постати популарнија метода сузбијања комараца49,50. Бенели51 је сугерисао да би рана контрола вектора комараца била ефикаснија у урбаним подручјима, али нису препоручили употребу ларвицида у руралним подручјима52. Том и др.53 такође сугерисали да би сузбијање комараца у њиховим незрелим фазама била безбедна и једноставна стратегија јер су осетљивији на средства за сузбијање 54.
Производња биосурфактаната од стране потентног соја (Enterobacter cloacae SJ2) показала је конзистентну и обећавајућу ефикасност. Наша претходна студија је известила да Enterobacter cloacae SJ2 оптимизује производњу биосурфактаната користећи физичко-хемијске параметре26. Према њиховој студији, оптимални услови за производњу биосурфактаната од стране потенцијалног изолата E. cloacae били су инкубација током 36 сати, мешање на 150 о/мин, pH 7,5, 37 °C, салинитет 1 ppt, 2% глукозе као извор угљеника, 1% квасца. Екстракт је коришћен као извор азота да би се добило 2,61 г/Л биосурфактаната. Поред тога, биосурфактани су окарактерисани коришћењем TLC, FTIR и MALDI-TOF-MS. Ово је потврдило да је рамнолипид биосурфактант. Гликолипидни биосурфактанди су најинтензивније проучавана класа других врста биосурфактаната55. Они се састоје од угљених хидрата и липидних делова, углавном ланаца масних киселина. Међу гликолипидима, главни представници су рамнолипид и софоролипид56. Рамнолипиди садрже два рамнозна остатка повезана са моно- или ди-β-хидроксидеканском киселином 57. Употреба рамнолипида у медицинској и фармацеутској индустрији је добро утврђена 58, поред њихове скорашње употребе као пестицида 59.
Интеракција биосурфактанта са хидрофобним регионом респираторног сифона омогућава води да прође кроз његову стоматалну шупљину, чиме се повећава контакт ларви са воденом средином. Присуство биосурфактанта такође утиче на трахеју, чија је дужина близу површине, што ларвама олакшава пузање до површине и дисање. Као резултат тога, површински напон воде се смањује. Пошто се ларве не могу причврстити за површину воде, падају на дно резервоара, нарушавајући хидростатички притисак, што резултира прекомерним утрошком енергије и смрћу утапањем38,60. Сличне резултате је добио Ghribi61, где је биосурфактант који производи Bacillus subtilis показао ларвицидно дејство против Ephestia kuehniella. Слично томе, ларвицидно дејство Cx. Das и Mukherjee23 такође је проценило ефекат цикличних липопептида на ларве quinquefasciatus.
Резултати ове студије се односе на ларвицидну активност рамнолипидних биосурфактаната против Cx. Убијање комараца quinquefasciatus је у складу са претходно објављеним резултатима. На пример, користе се биосурфактани на бази сурфактина које производе различите бактерије из рода Bacillus и Pseudomonas spp. Неки рани извештаји64,65,66 су пријавили активност убијања ларви липопептидних биосурфактаната из Bacillus subtilis23. Deepali и др.63 су открили да рамнолипидни биосурфактант изолован из Stenotropomonas maltophilia има снажну ларвицидну активност у концентрацији од 10 мг/Л. Silva и др.67 су пријавили ларвицидну активност рамнолипидног биосурфактаната против Ae у концентрацији од 1 г/Л. Aedes aegypti. Kanakdande и др. 68 је известио да липопептидни биосурфактанти које производи Bacillus subtilis изазивају укупни морталитет код ларви Culex и термита са липофилном фракцијом Eucalyptus-а. Слично томе, Масендра и др. 69 су известиле о морталитету радничких мрава (Cryptotermes cynocephalus Light.) од 61,7% у липофилним n-хексански и EtOAc фракцијама сировог екстракта E.
Партхипан и др. 70 су известили о инсектицидној употреби липопептидних биосурфактаната које производе Bacillus subtilis A1 и Pseudomonas stutzeri NA3 против Anopheles Stephensi, вектора паразита маларије Plasmodium. Приметили су да ларве и лутке дуже преживљавају, имају краћи период полагања јаја, стерилне су и имају краћи животни век када су третиране различитим концентрацијама биосурфактаната. Уочене LC50 вредности биосурфактаната B. subtilis A1 биле су 3,58, 4,92, 5,37, 7,10 и 7,99 мг/Л за различита стања ларве (тј. ларве I, II, III, IV и стадијум лутке), респективно. Поређења ради, биосурфактанси за стадијуме ларве I-IV и стадијуме лутке Pseudomonas stutzeri NA3 били су 2,61, 3,68, 4,48, 5,55 и 6,99 мг/Л, респективно. Сматра се да је одложена фенологија преживелих ларви и лутака резултат значајних физиолошких и метаболичких поремећаја изазваних третманима инсектицидима71.
Сој Wickerhamomyces anomalus CCMA 0358 производи биосурфактант са 100% ларвицидном активношћу против комараца Aedes. Интервал од 24 сата aegypti 38 био је већи него што су известили Силва и др. Показано је да биосурфактант произведен из Pseudomonas aeruginosa коришћењем сунцокретовог уља као извора угљеника убија 100% ларви у року од 48 сати 67. Абинаја и др.72 и Прадхан и др.73 такође су показали ларвицидне или инсектицидне ефекте сурфактанта које производи неколико изолата рода Bacillus. Претходно објављена студија Сентил-Натана и др. открила је да је 100% ларви комараца изложених биљним лагунама вероватно угинуло. 74.
Процена сублеталних ефеката инсектицида на биологију инсеката је кључна за интегрисане програме сузбијања штеточина, јер сублеталне дозе/концентрације не убијају инсекте, али могу смањити популације инсеката у будућим генерацијама нарушавањем биолошких карактеристика10. Сикеира и др.75 су приметили потпуну ларвицидну активност (100% морталитет) рамнолипидног биосурфактанта (300 мг/мл) када су тестирани у различитим концентрацијама у распону од 50 до 300 мг/мл. Ларвални стадијум сојева Aedes aegypti. Анализирали су ефекте времена до смрти и сублеталних концентрација на преживљавање ларви и активност пливања. Поред тога, приметили су смањење брзине пливања након 24–48 сати излагања сублеталним концентрацијама биосурфактанта (нпр. 50 мг/мл и 100 мг/мл). Сматра се да су отрови који имају обећавајуће сублеталне улоге ефикаснији у изазивању вишеструке штете на изложеним штеточинама76.
Хистолошка посматрања наших резултата указују да биосурфактанти које производи Enterobacter cloacae SJ2 значајно мењају ткива ларви комараца (Cx. quinquefasciatus) и термита (O. obesus). Сличне аномалије изазвали су препарати уља босиљка код An. gambiaes.s и An. arabica које је описао Очола77. Камараџ и др.78 такође су описали исте морфолошке абнормалности код An. Ларве Стефани биле су изложене златним наночестицама. Васанта-Сринивасан и др.79 такође су известили да је етерично уље пастирске торбе озбиљно оштетило комору и епителне слојеве Aedes albopictus. Aedes aegypti. Рагхавендран и др. известили су да су ларве комараца третиране са 500 мг/мл мицелијског екстракта локалне гљивице Penicillium. Ae показују озбиљна хистолошка оштећења. aegypti и Cx. Стопа морталитета 80. Претходно су Абинаја и др. проучавали ларве четвртог инстара An. Стефанси и Ae. aegypti је пронашао бројне хистолошке промене код Aedes aegypti третиране егзополисахаридима B. licheniformis, укључујући цекум желуца, атрофију мишића, оштећење и дезорганизацију ганглија нервних мождина72. Према Рагхавендрану и др., након третмана екстрактом мицелија P. daleae, ћелије средњег црева тестираних комараца (ларве 4. инстара) показале су отицање цревног лумена, смањење међућелијског садржаја и дегенерацију једра81. Исте хистолошке промене су примећене код ларви комараца третираних екстрактом листа ехинацеје, што указује на инсектицидни потенцијал третираних једињења50.
Употреба ECOSAR софтвера добила је међународно признање82. Тренутна истраживања указују на то да акутна токсичност ECOSAR биосурфактаната за микроалге (C. vulgaris), рибе и водене буве (D. magna) спада у категорију „токсичности“ коју су дефинисале Уједињене нације83. ECOSAR модел екотоксичности користи SAR и QSAR за предвиђање акутне и дугорочне токсичности супстанци и често се користи за предвиђање токсичности органских загађивача82,84.
Параформалдехид, натријум-фосфатни пуфер (pH 7,4) и све остале хемикалије коришћене у овој студији купљене су од HiMedia Laboratories, Индија.
Производња биосурфактаната је спроведена у Ерленмајеровим боцама од 500 мл које су садржале 200 мл стерилног Бушнеловог Хасовог медијума допуњеног са 1% сирове нафте као јединог извора угљеника. Прекултура Enterobacter cloacae SJ2 (1,4 × 104 CFU/ml) је инокулирана и култивисана на орбиталном шејкеру на 37°C, 200 о/мин током 7 дана. Након периода инкубације, биосурфактант је екстрахован центрифугирањем медијума за култивацију на 3400×g током 20 минута на 4°C, а добијени супернатант је коришћен за потребе скрининга. Поступци оптимизације и карактеризације биосурфактаната су усвојени из наше раније студије26.
Ларве *Culex quinquefasciatus* су добијене из Центра за напредне студије морске биологије (CAS), Паланчипетај, Тамил Наду (Индија). Ларве су узгајане у пластичним посудама напуњеним дејонизованом водом на температури од 27 ± 2°C и фотопериоду од 12:12 (светло:там). Ларве комараца су храњене 10% раствором глукозе.
Ларве Culex quinquefasciatus пронађене су у отвореним и незаштићеним септичким јамама. Користите стандардне смернице за класификацију за идентификацију и култивацију ларви у лабораторији85. Ларвицидни тестови су спроведени у складу са препорукама Светске здравствене организације86. SH. Ларве четвртог инстара quinquefasciatus сакупљене су у затвореним епруветама у групама од 25 ml и 50 ml са ваздушним зазором од две трећине њиховог капацитета. Биосурфактант (0–50 mg/ml) је додат у сваку епрувету појединачно и чуван на 25 °C. Контролна епрувета је користила само дестиловану воду (50 ml). Мртвим ларвама су сматране оне које нису показивале знаке пливања током периода инкубације (12–48 сати)87. Израчунајте проценат смртности ларви користећи једначину. (1)88.
Породица Odontotermitidae обухвата индијског термита Odontotermes obesus, пронађеног у трулим трупцима на Пољопривредном кампусу (Универзитет Анамалај, Индија). Тестирајте овај биосурфактант (0–50 мг/мл) користећи уобичајене поступке да бисте утврдили да ли је штетан. Након сушења у ламинарном протоку ваздуха током 30 минута, свака трака Ватман папира је премазана биосурфактантом у концентрацији од 30, 40 или 50 мг/мл. Претходно премазане и непремазане папирне траке су тестиране и упоређене у центру Петријеве шоље. Свака Петријева шоља садржи око тридесет активних термита O. obesus. Контролним и тест термитима је дат влажни папир као извор хране. Све плоче су држане на собној температури током периода инкубације. Термити су угинули након 12, 24, 36 и 48 сати89,90. Једначина 1 је затим коришћена за процену процента смртности термита при различитим концентрацијама биосурфактанта. (2).
Узорци су чувани на леду и упаковани у микроепрувете које садрже 100 мл 0,1 М натријум фосфатног пуфера (pH 7,4) и послати у Централну лабораторију за патологију аквакултуре (CAPL) Центра за аквакултуру „Раџив Ганди“ (RGCA), Лабораторија за хистологију, Сиркали, округ Мајиладутурај, Тамил Наду, Индија, ради даље анализе. Узорци су одмах фиксирани у 4% параформалдехиду на 37°C током 48 сати.
Након фазе фиксације, материјал је испран три пута са 0,1 М натријум фосфатним пуфером (pH 7,4), постепено дехидриран у етанолу и натопљен у LEICA смолу током 7 дана. Супстанца се затим ставља у пластични калуп напуњен смолом и полимеризатором, а затим се ставља у рерну загрејану на 37°C док се блок који садржи супстанцу потпуно не полимеризује.
Након полимеризације, блокови су исечени помоћу микротома LEICA RM2235 (Rankin Biomedical Corporation 10,399 Enterprise Dr. Davisburg, MI 48,350, САД) до дебљине од 3 мм. Пресеци су груписани на плочицама, са шест пресека по плочици. Плијенци су осушени на собној температури, затим обојени хематоксилином 7 минута и испрани текућом водом 4 минута. Поред тога, нанесите раствор еозина на кожу 5 минута и исперите текућом водом 5 минута.
Акутна токсичност је предвиђена коришћењем водених организама са различитих тропских нивоа: 96-часовна LC50 вредност за рибе, 48-часовна LC50 вредност за D. magna и 96-часовна EC50 вредност за зелене алге. Токсичност рамнолипидних биосурфактаната за рибе и зелене алге процењена је коришћењем ECOSAR софтвера верзије 2.2 за Windows који је развила Агенција за заштиту животне средине САД. (Доступно на мрежи на https://www.epa.gov/tsca-screening-tools/ecological-struct-activity-relationships-ecosar-predictive-model).
Сви тестови за ларвицидну и антитермитску активност спроведени су у три примерка. Нелинеарна регресија (логаритам варијабли одговора на дозу) података о смртности ларви и термита извршена је да би се израчунала средња летална концентрација (LC50) са интервалом поверења од 95%, а криве одговора на концентрацију су генерисане коришћењем програма Prism® (верзија 8.0, GraphPad Software) Inc., САД) 84, 91.
Ова студија открива потенцијал микробних биосурфактаната које производи Enterobacter cloacae SJ2 као ларвицидних и антитермитских средстава против комараца, а овај рад ће допринети бољем разумевању механизама ларвицидног и антитермитског дејства. Хистолошке студије ларви третираних биосурфактантима показале су оштећење дигестивног тракта, средњег црева, мождане коре и хиперплазију ћелија цревног епитела. Резултати: Токсиколошка евалуација антитермитске и ларвицидне активности рамнолипидног биосурфактаната које производи Enterobacter cloacae SJ2 открила је да је овај изолат потенцијални биопестицид за контролу векторских болести комараца (Cx quinquefasciatus) и термита (O. obesus). Потребно је разумети основну токсичност биосурфактаната по животну средину и њихов потенцијални утицај на животну средину. Ова студија пружа научну основу за процену ризика биосурфактаната по животну средину.
Време објаве: 09. април 2024.