Борова нематода је карантински миграторни ендопаразит за који је познато да узрокује озбиљне економске губитке у екосистемима борових шума. Ова студија разматра нематицидну активност халогенизованих индола против борових нематода и њихов механизам деловања. Нематицидне активности 5-јодоиндола и авермектина (позитивна контрола) против борових нематода биле су сличне и високе при ниским концентрацијама (10 μг/мЛ). 5-јодоиндол је смањио плодност, репродуктивну активност, смртност ембриона и ларви и локомоторно понашање. Молекуларне интеракције лиганада са рецепторима хлоридних канала који су специфични за бескичмењаке подржавају идеју да се 5-јодоиндол, попут авермектина, чврсто везује за активно место рецептора. 5-јодоиндол је такође изазвао различите фенотипске деформације код нематода, укључујући абнормални колапс/скупљање органа и повећану вакуолизацију. Ови резултати сугеришу да вакуоле могу играти улогу у смрти изазваној метилацијом нематода. Важно је да 5-јодоиндол није био токсичан за обе биљне врсте (купус и роткву). Дакле, ова студија показује да примена јодоиндола у условима околине може контролисати повреду боровог увенућа.
Нематода борове шуме (Бурсапхеленцхус килопхилус) припада нематодама борове шуме (ПВН), миграторним ендопаразитским нематодама за које је познато да узрокују тешка еколошка оштећења екосистема борових шума1. Болест боровог увенућа (ПВД) узрокована нематодом борове шуме постаје озбиљан проблем на неколико континената, укључујући Азију и Европу, а у Северној Америци нематода уништава интродуковане врсте бора1,2. Пропадање борова је велики економски проблем, а изгледи за његово глобално ширење су забрињавајући3. Нематода најчешће напада следеће врсте бора: Пинус денсифлора, Пинус силвестрис, Пинус тхунбергии, Пинус кораиенсис, Пинус тхунбергии, Пинус тхунбергии и Пинус радиата4. Борова нематода је озбиљна болест која може убити борове у року од неколико недеља или месеци од инфекције. Поред тога, епидемије борових нематода су уобичајене у различитим екосистемима, тако да су успостављени упорни ланци инфекције1.
Бурсапхеленцхус килопхилус је карантинска биљно-паразитска нематода која припада суперфамилији Апхеленцхоидеа и кладе 102.5. Нематода се храни гљивама и размножава се у дрвеном ткиву борова, развијајући се у четири различите ларвалне фазе: Л1, Л2, Л3, Л4 и одраслу јединку1,6. У условима несташице хране, борова нематода прелази у специјализовани ларвални стадијум – дауер, који паразитира на свом вектору – борову поткорњачу (Моноцхамус алтернатус) и преноси се на здрава стабла бора. Код здравих домаћина нематоде брзо мигрирају кроз биљна ткива и хране се паренхиматозним ћелијама, што доводи до бројних реакција преосетљивости, увенућа бора и смрти у року од годину дана након инфекције1,7,8.
Биолошка контрола борових нематода дуго је представљала изазов, а мере карантина датирају још из 20. века. Тренутне стратегије за сузбијање борових нематода првенствено укључују хемијске третмане, укључујући фумигацију дрвета и имплантацију нематицида у стабла дрвећа. Најчешће коришћени нематициди су авермектин и авермектин бензоат, који припадају породици авермектина. Ове скупе хемикалије су веома ефикасне против многих врста нематода и сматрају се еколошки безбедним9. Међутим, очекује се да ће поновљена употреба ових нематицида створити притисак селекције који ће готово сигурно довести до појаве отпорних борових нематода, као што је показано за неколико штеточина инсеката, као што су Лептинотарса децемлинеата, Плутелла килостелла и нематоде Трицхостронгилус цолубриформис и Остертагиа цирцум, које су постепено развиле отпорност на авермектини10,11,12. Због тога је потребно редовно проучавати обрасце отпорности и континуирано прегледати нематициде како би се пронашле алтернативне, исплативе и еколошки прихватљиве мере за контролу ПВД. Последњих деценија, један број аутора је предложио употребу биљних екстраката, етеричних уља и испарљивих материја као средстава за контролу нематода13,14,15,16.
Недавно смо показали нематицидну активност индола, међућелијског и међукраљевског сигналног молекула, у Цаенорхабдитис елеганс 17 . Индол је широко распрострањен интрацелуларни сигнал у микробној екологији, контролишући бројне функције које утичу на физиологију микроба, формирање спора, стабилност плазмида, отпорност на лекове, формирање биофилма и вируленцију 18, 19 . Активност индола и његових деривата против других патогених нематода није проучавана. У овој студији смо истражили нематицидну активност 34 индола против борових нематода и разјаснили механизам деловања најмоћнијег 5-јодоиндола користећи микроскопију, тиме-лапсе фотографију и експерименте молекуларног спајања, и проценили његове токсичне ефекте на биљке помоћу теста клијања семена.
Раније је пријављено да високе концентрације (>1,0 мМ) индола имају нематицидни ефекат на нематоде17. Након третмана Б. килопхилус (мешовити животни стадијуми) са индолом или 33 различита деривата индола у 1 мМ, морталитет Б. килопхилус је мерен бројањем живих и мртвих нематода у контролној и третираној групи. Пет индола је показало значајну нематицидну активност; преживљавање нетретиране контролне групе било је 95 ± 7% након 24 х. Од 34 тестирана индола, 5-јодоиндол и 4-флуороиндол у дози од 1 мМ изазвали су 100% смртности, док су 5,6-дифлуороиндиго, метилиндол-7-карбоксилат и 7-јодоиндол узроковали приближно 50% морталитета (Табела 1).
Ефекат 5-јодоиндола на формирање вакуола и метаболизам нематоде боровог дрвета. (А) Ефекат авермектина и 5-јодоиндола на одрасле мушке нематоде, (Б) јаја нематода Л1 стадијума и (Ц) метаболизам Б. килопхилус, (и) вакуоле нису примећене у 0 х, третман је резултирао (ии) вакуолама, (иии) акумулацијом вишеструких вакуола (иии) акумулацијом вишеструких вакуола (в) фузију вакуола и (ви) формирање џиновских вакуола. Црвене стрелице означавају отицање вакуола, плаве стрелице означавају фузију вакуола, а црне стрелице указују на џиновске вакуоле. Скала бар = 50 μм.
Поред тога, ова студија је такође описала секвенцијални процес смрти изазване метаном код борових нематода (слика 4Ц). Метаногена смрт је неапоптотични тип ћелијске смрти повезан са акумулацијом истакнутих цитоплазматских вакуола27. Чини се да су морфолошки дефекти уочени код борових нематода уско повезани са механизмом смрти изазване метаном. Микроскопско испитивање у различито време показало је да су се џиновске вакуоле формирале након 20 х излагања 5-јодоиндолу (0,1 мМ). Микроскопске вакуоле су уочене након 8 х третмана, а њихов број се повећао након 12 х. Неколико великих вакуола је примећено након 14 х. Неколико спојених вакуола било је јасно видљиво након 12–16 х третмана, што указује да је фузија вакуола основа механизма метаногене смрти. После 20 сати, неколико џиновских вакуола је пронађено у целом црву. Ова запажања представљају први извештај о метуози код Ц. елеганс.
Код црва третираних са 5-јодоиндолом, такође је примећена агрегација и руптура вакуола (слика 5), што је доказано савијањем црва и ослобађањем вакуоле у околину. Поремећај вакуоле је такође примећен у мембрани љуске јајета, која је нормално очувана нетакнутом од стране Л2 током излегања (додатна слика С2). Ова запажања подржавају укључивање акумулације течности и неуспеха осморегулације, као и реверзибилне повреде ћелија (РЦИ), у процесу формирања вакуола и суппуратиона (слика 5).
Постављајући хипотезу о улози јода у уоченом формирању вакуола, истражили смо нематицидну активност натријум јодида (НаИ) и калијум јодида (КИ). Међутим, у концентрацијама (0,1, 0,5 или 1 мМ), они нису утицали ни на преживљавање нематода ни на формирање вакуола (додатна слика С5), иако је 1 мМ КИ имао благи нематицидни ефекат. С друге стране, 7-јодоиндол (1 или 2 мМ), попут 5-јодоиндола, индуковао је вишеструке вакуоле и структурне деформације (додатна слика С6). Два јодоиндола су показала сличне фенотипске карактеристике код борових нематода, док НаИ и КИ нису. Занимљиво је да индол није индуковао формирање вакуоле у Б. килопхилус у тестираним концентрацијама (подаци нису приказани). Дакле, резултати су потврдили да је комплекс индол-јод одговоран за вакуолизацију и метаболизам Б. килопхилус.
Међу индолима тестираним на нематицидну активност, 5-јодоиндол је имао највећи индекс клизања од -5,89 кцал/мол, затим 7-јодоиндол (-4,48 кцал/мол), 4-флуороиндол (-4,33) и индол (-4,03) (Слика 6). Снажна водонична веза 5-јодоиндола за леуцин 218 стабилизује његово везивање, док се сви остали деривати индола везују за серин 260 преко водоничних веза бочног ланца. Међу осталим моделованим јодоиндолима, 2-јодоиндол има везујућу вредност од -5,248 кцал/мол, што је због његове главне водоничне везе са леуцином 218. Остала позната везивања укључују 3-јодоиндол (-4,3 кцал/мол), 4-јодоиндол (-4,3 кцал/мол), 4-јодоиндол (-4,6 кцал/моол), и 6 флуороиндол (-4,0. кцал/мол) (додатна слика С8). Већина халогенизованих индола и самог индола, са изузетком 5-јодоиндола и 2-јодоиндола, формирају везу са серином 260. Чињеница да водонична веза са леуцином 218 указује на ефикасно везивање рецептор-лиганд, као што је примећено за ивермектин (Сл. 2-јодоиндол, попут ивермектина, се чврсто везује за активно место ГлуЦЛ рецептора преко леуцина 218 (слика 6 и додатна слика С8). Предлажемо да је ово везивање потребно да би се одржала структура отворених пора ГлуЦЛ комплекса и да чврстим везивањем за активно место ГлуЦЛ рецептора, 5-јодоиндол, 2-јодоиндол, авермектин и ивермектин на тај начин одржавају јонски канал отвореним и омогућавају узимање течности.
Молекуларно спајање индола и халогенованог индола на ГлуЦЛ. Оријентације везивања (А) индола, (Б) 4-флуороиндола, (Ц) 7-јодоиндола и (Д) 5-јодоиндол лиганда за активно место ГлуЦЛ. Протеин је представљен траком, а водоничне везе кичме су приказане као жуте испрекидане линије. (А′), (Б′), (Ц′) и (Д′) показују интеракције одговарајућих лиганада са околним аминокиселинским остацима, а водоничне везе бочног ланца су означене ружичастим тачкастим стрелицама.
Експерименти су спроведени да би се проценио токсични ефекат 5-јодоиндола на клијање семена купуса и ротквице. 5-јодоиндол (0,05 или 0,1 мМ) или авермектин (10 μг/мЛ) су имали мали или никакав утицај на почетно клијање и ницање садница (Слика 7). Поред тога, није пронађена значајна разлика између стопе клијања необрађених контрола и семена третираних 5-јодоиндолом или авермектином. Утицај на издужење главног корена и број формираних бочних корена био је безначајан, иако је 1 мМ (10 пута већа од активне концентрације) 5-јодоиндола благо одлагао развој бочних корена. Ови резултати показују да је 5-јодоиндол нетоксичан за биљне ћелије и да не омета процесе развоја биљака у проучаваним концентрацијама.
Утицај 5-јодоиндола на клијање семена. Клијање, ницање и бочно корење семена Б. олерацеа и Р. рапханиструм на Мурасхиге и Скоог агар подлози са или без авермектина или 5-јодоиндола. Клијање је забележено након 3 дана инкубације на 22°Ц.
Ова студија извештава о неколико случајева убијања нематода индолима. Важно је да је ово први извештај о метилацији јодоиндола која изазива метилацију (процес узрокован акумулацијом малих вакуола које се постепено спајају у џиновске вакуоле, што на крају доводи до пуцања мембране и смрти) у боровим иглицама, при чему јодоиндол показује значајна нематицидна својства слична онима код комерцијалног нематицида и нематица.
Раније је пријављено да индоли врше вишеструке сигналне функције код прокариота и еукариота, укључујући инхибицију/формирање биофилма, преживљавање бактерија и патогеност19,32,33,34. Недавно су потенцијални терапијски ефекти халогенизованих индола, индол алкалоида и полусинтетичких деривата индола привукли велико истраживачко интересовање35,36,37. На пример, показало се да халогеновани индоли убијају упорне ћелије Есцхерицхиа цоли и Стапхилоцоццус ауреус37. Поред тога, од научног је интереса проучавати ефикасност халогенизованих индола против других врста, родова и краљевстава, а ова студија је корак ка постизању овог циља.
Овде предлажемо механизам за смртност изазвану 5-јодоиндолом код Ц. елеганс на основу реверзибилне повреде ћелија (РЦИ) и метилације (Слике 4Ц и 5). Едематозне промене као што су надутост и вакуолна дегенерација су индикатори РЦИ и метилације, манифестују се као џиновске вакуоле у цитоплазми48,49. РЦИ омета производњу енергије смањујући производњу АТП-а, узрокујући квар АТПазне пумпе, или ометајући ћелијске мембране и изазивајући брз прилив На+, Ца2+ и воде50,51,52. Интрацитоплазматске вакуоле настају у животињским ћелијама као резултат акумулације течности у цитоплазми услед прилива Ца2+ и воде53. Занимљиво је да је овај механизам оштећења ћелија реверзибилан ако је оштећење привремено и ћелије почну да производе АТП током одређеног временског периода, али ако оштећење опстане или се погорша, ћелије умиру.54 Наша запажања показују да нематоде третиране 5-јодоиндолом нису у стању да обнове нормалну биосинтезу након излагања стресним условима.
Фенотип метилације изазван 5-јодоиндолом у Б. килопхилус може бити последица присуства јода и његове молекуларне дистрибуције, пошто је 7-јодоиндол имао мањи инхибиторни ефекат на Б. килопхилус него 5-јодоиндол (табела 1 и додатна слика С6). Ови резултати су делимично у складу са студијама Малтесе ет ал. (2014), који је известио да је транслокација пиридилног азотног дела у индолу са пара- на мета-позицију укинула вакуолизацију, инхибицију раста и цитотоксичност у У251 ћелијама, што сугерише да је интеракција молекула са специфичним активним местом у протеину критична27,44,45. Интеракције између индола или халогенованих индола и ГлуЦЛ рецептора уочене у овој студији такође подржавају ову идеју, јер је утврђено да се 5- и 2-јодоиндол јаче везују за ГлуЦЛ рецепторе од осталих испитаних индола (Слика 6 и Додатна слика С8). Утврђено је да се јод на другој или петој позицији индола везује за леуцин 218 ГлуЦЛ рецептора преко водоничних веза у кичми, док други халогеновани индоли и сам индол формирају слабе водоничне везе бочног ланца са серином 260 (Слика 6). Стога спекулишемо да локализација халогена игра важну улогу у индукцији вакуолне дегенерације, док чврсто везивање 5-јодоиндола држи јонски канал отвореним, чиме се омогућава брз прилив течности и руптура вакуоле. Међутим, остаје да се утврди детаљан механизам деловања 5-јодоиндола.
Пре практичне примене 5-јодоиндола треба анализирати његово токсично дејство на биљке. Наши експерименти клијања семена су показали да 5-јодоиндол није имао негативан утицај на клијавост семена или касније развојне процесе при проучаваним концентрацијама (Слика 7). Дакле, ова студија даје основу за употребу 5-јодоиндола у еколошкој средини за контролу штетности борових нематода на борове стабла.
Претходни извештаји су показали да терапија заснована на индолу представља потенцијални приступ за решавање проблема резистенције на антибиотике и прогресије рака55. Поред тога, индоли поседују антибактеријске, антиканцерогене, антиоксидативне, антиинфламаторне, антидијабетичке, антивирусне, антипролиферативне и антитуберкулозне активности и могу послужити као обећавајућа основа за развој лекова56,57. Ова студија по први пут указује на потенцијалну употребу јода као антипаразитског и антхелминтичког средства.
Авермектин је откривен пре три деценије и добио је Нобелову награду 2015. године, а његова употреба као антхелминтика још увек је активно у току. Међутим, због брзог развоја отпорности на авермектине код нематода и штеточина инсеката, потребна је алтернативна, јефтина и еколошки прихватљива стратегија за контролу инфекције борове борове борове. Ова студија такође извештава о механизму којим 5-јодоиндол убија борове нематоде и да 5-јодоиндол има ниску токсичност за биљне ћелије, што отвара добре изгледе за његову будућу комерцијалну примену.
Све експерименте је одобрио Етички комитет Универзитета Иеунгнам, Гиеонгсан, Кореја, а методе су изведене у складу са смерницама Етичког комитета Универзитета Иеунгнам.
Експерименти инкубације јаја су изведени применом утврђених процедура43. Да би се проценила стопа излегања (ХР), одрасле нематоде старе 1 дан (отприлике 100 женки и 100 мужјака) су пребачене у Петријеве посуде које садрже гљивицу и остављене да расту 24 х. Јаја су затим изолована и третирана са 5-јодоиндолом (0,05 мМ и 0,1 мМ) или авермектином (10 μг/мл) као суспензијом у стерилној дестилованој води. Ове суспензије (500 μл; приближно 100 јаја) су пребачене у бунарчиће плоче за културу ткива са 24 бунара и инкубиране на 22 °Ц. Бројање Л2 је направљено након 24 х инкубације, али се сматрало мртвим ако се ћелије нису померале када су стимулисане фином платинастом жицом. Овај експеримент је спроведен у две фазе, свака са шест понављања. Подаци из оба експеримента су комбиновани и представљени. Проценат ХР се израчунава на следећи начин:
Смртност ларви је процењена коришћењем претходно развијених процедура. Јаја нематода су сакупљена и ембриони су синхронизовани излежавањем у стерилној дестилованој води да би се створиле ларве Л2 фазе. Синхронизоване ларве (приближно 500 нематода) третиране су са 5-јодоиндолом (0,05 мМ и 0,1 мМ) или авермектином (10 μг/мл) и узгајане на Б. цинереа Петри плочама. После 48 х инкубације на 22 ° Ц, нематоде су сакупљене у стерилној дестилованој води и испитане на присуство Л2, Л3 и Л4 стадијума. Присуство Л3 и Л4 стадијума указује на трансформацију ларве, док присуство Л2 стадијума не указује на трансформацију. Слике су добијене коришћењем иРиС™ Дигитал Целл Имагинг Систем. Овај експеримент је спроведен у две фазе, свака са шест понављања. Подаци из оба експеримента су комбиновани и представљени.
Токсичност 5-јодоиндола и авермектина за семе је процењена коришћењем тестова клијања на Мурасхиге и Скоог агар плочама.62 Семе Б. олерацеа и Р. рапханиструм је прво натопљено у стерилну дестиловану воду један дан, испрано са 1 мл 100% ол-а, комерцијално стерилизованог са 3% мл 0 од 1 мл натријум хипохлорит) током 15 мин, и испрати пет пута са 1 мл стерилне воде. Стерилизовано семе је затим пресовано на плоче са агаром за клијање које садрже 0,86 г/л (0,2Кс) Мурасхиге и Скоог медијума и 0,7% бактериолошког агара са или без 5-јодоиндола или авермектина. Плоче су затим инкубиране на 22 °Ц, а слике су снимљене након 3 дана инкубације. Овај експеримент је спроведен у две фазе, од којих је свака имала шест понављања.
Време поста: 26.02.2025