Борова нематода је карантински миграторни ендопаразит за који се зна да изазива озбиљне економске губитке у екосистемима борових шума. Ова студија разматра нематицидну активност халогенованих индола против борових нематода и њихов механизам деловања. Нематицидна активност 5-јодоиндола и авермектина (позитивна контрола) против борових нематода била је слична и висока при ниским концентрацијама (10 μг/мл). 5-јодоиндол је смањио плодност, репродуктивну активност, ембрионални и ларвални морталитет и локомоторно понашање. Молекуларне интеракције лиганда са рецепторима глутамат-контролисаних хлоридних канала специфичним за бескичмењаке подржавају идеју да се 5-јодоиндол, попут авермектина, чврсто везује за активно место рецептора. 5-јодоиндол је такође изазвао разне фенотипске деформације код нематода, укључујући абнормални колапс/скупљање органа и повећану вакуолизацију. Ови резултати сугеришу да вакуоле могу играти улогу у смрти посредованој метилацијом нематода. Важно је напоменути да 5-јодоиндол није био токсичан за обе биљне врсте (купус и ротквицу). Дакле, ова студија показује да примена јодоиндола у условима околине може контролисати оштећења од увенућа бора.
Борова нематода (Bursaphelenchus xylophilus) припада боровим нематодама (PWN), миграторним ендопаразитским нематодама за које се зна да изазивају озбиљну еколошку штету екосистемима борових шума1. Болест увенућа бора (PWD) коју изазива борова нематода постаје озбиљан проблем на неколико континената, укључујући Азију и Европу, а у Северној Америци нематода уништава уведене врсте борова1,2. Пропадање борова је велики економски проблем, а изгледи за њено глобално ширење су забрињавајући3. Следеће врсте борова најчешће су нападнуте нематодом: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii и Pinus radiata4. Борова нематода је озбиљна болест која може убити борове у року од неколико недеља или месеци од инфекције. Поред тога, епидемије борових нематода су честе у различитим екосистемима, тако да су успостављени перзистентни ланци инфекције1.
Bursaphelenchus xylophilus је карантинска биљно-паразитска нематода која припада суперфамилији Aphelenchoidea и клади 102.5. Нематода се храни гљивицама и размножава се у дрвеним ткивима борова, развијајући се у четири различита ларвална стадијума: L1, L2, L3, L4 и одраслу јединку1,6. У условима несташице хране, борова нематода прелази у специјализовани ларвални стадијум – дауер, који паразитира на свом вектору – боровом поткорњаку (Monochamus alternatus) и преноси се на здраве борове. Код здравих домаћина, нематоде брзо мигрирају кроз биљна ткива и хране се паренхиматозним ћелијама, што доводи до низа реакција преосетљивости, венућа бора и смрти у року од годину дана након инфекције1,7,8.
Биолошка контрола борових нематода дуго је представљала изазов, а карантинске мере датирају још из 20. века. Тренутне стратегије за контролу борових нематода првенствено укључују хемијске третмане, укључујући фумигацију дрвета и имплантацију нематицида у дебла дрвећа. Најчешће коришћени нематициди су авермектин и авермектин бензоат, који припадају породици авермектина. Ове скупе хемикалије су веома ефикасне против многих врста нематода и сматрају се безбедним за животну средину9. Међутим, очекује се да ће поновљена употреба ових нематицида створити селекциони притисак који ће готово сигурно довести до појаве отпорних борових нематода, као што је показано код неколико инсеката штеточина, као што су Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella и нематоде Trichostrongylus colubriformis и Ostertagia circumcincta, које су постепено развиле отпорност на авермектине10,11,12. Стога, обрасце отпорности треба редовно проучавати, а нематициде континуирано пратити како би се пронашле алтернативне, исплативе и еколошки прихватљиве мере за контролу PVD. У последњим деценијама, бројни аутори су предложили употребу биљних екстраката, етеричних уља и испарљивих супстанци као средстава за сузбијање нематода13,14,15,16.
Недавно смо показали нематицидну активност индола, интерцелуларног и интерцарственог сигналног молекула, код Caenorhabditis elegans 17. Индол је широко распрострањени интрацелуларни сигнал у микробној екологији, који контролише бројне функције које утичу на микробну физиологију, формирање спора, стабилност плазмида, отпорност на лекове, формирање биофилма и вируленцију 18, 19. Активност индола и његових деривата против других патогених нематода није проучавана. У овој студији, истражили смо нематицидну активност 34 индола против борових нематода и разјаснили механизам деловања најјачег 5-јодоиндола користећи микроскопију, убрзано снимање и експерименте молекуларног доковања, и проценили његове токсичне ефекте на биљке користећи тест клијавости семена.
Високе концентрације индола (>1,0 mM) су раније пријављене као нематоцидни ефекат на нематоде17. Након третмана B. xylophilus (мешовити животни стадијуми) индолом или 33 различита деривата индола у концентрацији од 1 mM, морталитет B. xylophilus је мерен бројањем живих и мртвих нематода у контролној и третираној групи. Пет индола је показало значајну нематоцидну активност; преживљавање нетретиране контролне групе било је 95 ± 7% након 24 сата. Од 34 тестирана индола, 5-јодоиндол и 4-флуороиндол у концентрацији од 1 mM изазвали су 100% морталитета, док су 5,6-дифлуороиндиго, метилиндол-7-карбоксилат и 7-јодоиндол изазвали приближно 50% морталитета (Табела 1).
Утицај 5-јодоиндола на формирање вакуола и метаболизам борове нематоде. (А) Утицај авермектина и 5-јодоиндола на одрасле мужјаке нематода, (Б) јаја нематоде стадијума L1 и (Ц) метаболизам B. xylophilus, (i) вакуоле нису примећене након 0 сати, третман је резултирао (ii) вакуолама, (iii) акумулацијом вишеструких вакуола, (iv) отицањем вакуола, (v) фузијом вакуола и (vi) формирањем џиновских вакуола. Црвене стрелице означавају отицање вакуола, плаве стрелице означавају фузију вакуола, а црне стрелице означавају џиновске вакуоле. Скала = 50 μm.
Поред тога, ова студија је такође описала секвенцијални процес смрти изазване метаном код борових нематода (слика 4Ц). Метаногена смрт је неапоптотски тип ћелијске смрти повезан са акумулацијом истакнутих цитоплазматских вакуола27. Морфолошки дефекти примећени код борових нематода изгледа да су уско повезани са механизмом смрти изазване метаном. Микроскопски преглед у различито време показао је да су се џиновске вакуоле формирале након 20 сати излагања 5-јодоиндолу (0,1 mM). Микроскопске вакуоле су примећене након 8 сати третмана, а њихов број се повећао након 12 сати. Неколико великих вакуола је примећено након 14 сати. Неколико спојених вакуола било је јасно видљиво након 12–16 сати третмана, што указује да је фузија вакуола основа механизма метаногене смрти. Након 20 сати, неколико џиновских вакуола је пронађено широм црва. Ова запажања представљају први извештај о метуози код C. elegans.
Код црва третираних 5-јодоиндолом, такође је примећена агрегација и руптура вакуола (Сл. 5), што је доказано савијањем црва и ослобађањем вакуола у околину. Поремећај вакуола је такође примећен у мембрани љуске јајета, коју L2 нормално очува нетакнутом током излегања (Допунска слика S2). Ова запажања подржавају учешће акумулације течности и осморегулаторног отказа, као и реверзибилног оштећења ћелија (RCI), у процесу формирања вакуола и супурације (Сл. 5).
Претпостављајући улогу јода у посматраном формирању вакуола, истражили смо нематицидну активност натријум јодида (NaI) и калијум јодида (KI). Међутим, при концентрацијама (0,1, 0,5 или 1 mM), нису утицали ни на преживљавање нематода ни на формирање вакуола (Допунска слика S5), иако је 1 mM KI имао благи нематицидни ефекат. С друге стране, 7-јодоиндол (1 или 2 mM), као и 5-јодоиндол, индуковао је вишеструке вакуоле и структурне деформације (Допунска слика S6). Два јодоиндола показала су сличне фенотипске карактеристике код борових нематода, док NaI и KI нису. Занимљиво је да индол није индуковао формирање вакуола код B. xylophilus при тестираним концентрацијама (подаци нису приказани). Дакле, резултати су потврдили да је комплекс индол-јод одговоран за вакуолизацију и метаболизам B. xylophilus.
Међу индолима тестираним на нематицидну активност, 5-јодоиндол је имао највећи индекс клизања од -5,89 kcal/mol, затим 7-јодоиндол (-4,48 kcal/mol), 4-флуороиндол (-4,33) и индол (-4,03) (слика 6). Јака водонична веза 5-јодоиндола са леуцином 218 стабилизује његово везивање, док се сви остали деривати индола везују за серин 260 преко водоничних веза бочног ланца. Међу осталим моделираним јодоиндолима, 2-јодоиндол има вредност везивања од -5,248 kcal/mol, што је последица његове главне водоничне везе са леуцином 218. Остала позната везивања укључују 3-јодоиндол (-4,3 kcal/mol), 4-јодоиндол (-4,0 kcal/mol) и 6-флуороиндол (-2,6 kcal/mol) (Додатна слика S8). Већина халогенизованих индола и сам индол, са изузетком 5-јодоиндола и 2-јодоиндола, формирају везу са серином 260. Чињеница да водонична веза са леуцином 218 указује на ефикасно везивање рецептор-лиганд, као што је примећено код ивермектина (Допунска слика S7), потврђује да се 5-јодоиндол и 2-јодоиндол, попут ивермектина, чврсто везују за активно место GluCL рецептора преко леуцина 218 (Слика 6 и Допунска слика S8). Претпостављамо да је ово везивање неопходно за одржавање отворене структуре пора GluCL комплекса и да чврстим везивањем за активно место GluCL рецептора, 5-јодоиндол, 2-јодоиндол, авермектин и ивермектин тако одржавају јонски канал отвореним и омогућавају апсорпцију течности.
Молекуларно везивање индола и халогенованог индола за GluCL. Оријентације везивања (А) индолских, (Б) 4-флуороиндолских, (Ц) 7-јодоиндолских и (Д) 5-јодоиндолских лиганда за активно место GluCL. Протеин је представљен траком, а водоничне везе у ланцу су приказане као жуте испрекидане линије. (А′), (Б′), (Ц′) и (Д′) показују интеракције одговарајућих лиганда са околним остацима аминокиселина, а водоничне везе бочних ланаца су означене ружичастим испрекиданим стрелицама.
Експерименти су спроведени да би се проценио токсични ефекат 5-јодоиндола на клијање семена купуса и роткве. 5-јодоиндол (0,05 или 0,1 mM) или авермектин (10 μg/mL) имали су мали или никакав утицај на почетно клијање и ницање биљака (Слика 7). Поред тога, није пронађена значајна разлика између стопе клијања нетретираних контрола и семена третираних 5-јодоиндолом или авермектином. Ефекат на издуживање главног корена и број формираних бочних корена био је безначајан, иако је 1 mM (10 пута већа од активне концентрације) 5-јодоиндола благо одложио развој бочних корена. Ови резултати указују да је 5-јодоиндол нетоксичан за биљне ћелије и да не омета процесе развоја биљака при проучаваним концентрацијама.
Утицај 5-јодоиндола на клијање семена. Клијање, ницање и бочно ожиљавање семена B. oleracea и R. raphanistrum на Мурашиге и Скуг агар медијуму са или без авермектина или 5-јодоиндола. Клијање је забележено након 3 дана инкубације на 22°C.
Ова студија извештава о неколико случајева убијања нематода индолима. Важно је напоменути да је ово први извештај о јодоиндолу који индукује метилацију (процес узрокован акумулацијом малих вакуола које се постепено спајају у џиновске вакуоле, што на крају доводи до пуцања мембране и смрти) у боровим иглицама, при чему јодоиндол показује значајна нематицидна својства слична онима комерцијалног нематицида авермектина.
Раније је објављено да индоли имају вишеструке сигналне функције код прокариота и еукариота, укључујући инхибицију/формирање биофилма, преживљавање бактерија и патогеност 19, 32, 33, 34. Недавно су потенцијални терапеутски ефекти халогенованих индола, индол алкалоида и полусинтетских индол деривата привукли велико истраживачко интересовање 35, 36, 37. На пример, показано је да халогеновани индоли убијају перзистентне ћелије Escherichia coli и Staphylococcus aureus 37. Поред тога, од научног је интереса проучити ефикасност халогенованих индола против других врста, родова и царстава, а ова студија је корак ка постизању овог циља.
Овде предлажемо механизам за смртност изазвану 5-јодоиндолом код C. elegans заснован на реверзибилном оштећењу ћелија (RCI) и метилацији (слике 4C и 5). Едематозне промене попут отока и вакуоларне дегенерације су индикатори RCI и метилације, које се манифестују као џиновске вакуоле у цитоплазми48,49. RCI омета производњу енергије смањењем производње АТП-а, узрокујући отказ АТПазне пумпе или ометањем ћелијских мембрана и изазивањем брзог прилива Na+, Ca2+ и воде50,51,52. Интрацитоплазматске вакуоле настају у животињским ћелијама као резултат акумулације течности у цитоплазми услед прилива Ca2+ и воде53. Занимљиво је да је овај механизам оштећења ћелија реверзибилан ако је оштећење привремено и ћелије почну да производе АТП током одређеног временског периода, али ако оштећење потраје или се погорша, ћелије умиру.54 Наша запажања показују да нематоде третиране 5-јодоиндолом нису у стању да обнове нормалну биосинтезу након излагања стресним условима.
Метилациони фенотип индукован 5-јодоиндолом код B. xylophilus може бити последица присуства јода и његове молекуларне дистрибуције, пошто је 7-јодоиндол имао мањи инхибиторни ефекат на B. xylophilus него 5-јодоиндол (Табела 1 и Додатна слика S6). Ови резултати су делимично у складу са студијама Малтезеа и др. (2014), који су известили да је транслокација пиридил азотног дела у индолу из пара- у мета-положај укинула вакуолизацију, инхибицију раста и цитотоксичност у ћелијама U251, што сугерише да је интеракција молекула са специфичним активним местом у протеину критична27,44,45. Интеракције између индола или халогенизованих индола и GluCL рецептора примећене у овој студији такође подржавају ову идеју, јер је утврђено да се 5- и 2-јодоиндол јаче везују за GluCL рецепторе од осталих испитиваних индола (Слика 6 и Додатна слика S8). Утврђено је да се јод на другој или петој позицији индола везује за леуцин 218 GluCL рецептора путем водоничних веза у основом ланца, док други халогеновани индоли и сам индол формирају слабе водоничне везе бочног ланца са серином 260 (слика 6). Стога претпостављамо да локализација халогена игра важну улогу у индукцији вакуоларне дегенерације, док чврсто везивање 5-јодоиндола држи јонски канал отвореним, чиме омогућава брз прилив течности и руптуру вакуоле. Међутим, детаљан механизам деловања 5-јодоиндола тек треба да се утврди.
Пре практичне примене 5-јодоиндола, треба анализирати његов токсични ефекат на биљке. Наши експерименти клијања семена показали су да 5-јодоиндол није имао негативан ефекат на клијање семена или накнадне процесе развоја при проучаваним концентрацијама (Слика 7). Стога, ова студија пружа основу за употребу 5-јодоиндола у еколошком окружењу за контролу штетности борових нематода за борове.
Претходни извештаји су показали да терапија заснована на индолу представља потенцијални приступ решавању проблема резистенције на антибиотике и прогресије рака55. Поред тога, индоли поседују антибактеријска, антиканцерогена, антиоксидативна, антиинфламаторна, антидијабетичка, антивирусна, антипролиферативна и антитуберкулозна дејства и могу послужити као обећавајућа основа за развој лекова56,57. Ова студија први пут сугерише потенцијалну употребу јода као антипаразитског и антихелминтског средства.
Авермектин је откривен пре три деценије и освојио је Нобелову награду 2015. године, а његова употреба као антихелминтика је и даље активно у току. Међутим, због брзог развоја резистенције на авермектине код нематода и инсеката штеточина, потребна је алтернативна, јефтинија и еколошки прихватљива стратегија за контролу инфекције боровом болешћу. Ова студија такође извештава о механизму којим 5-јодоиндол убија борове нематоде и да 5-јодоиндол има ниску токсичност за биљне ћелије, што отвара добре изгледе за његову будућу комерцијалну примену.
Све експерименте је одобрио Етички комитет Универзитета Јеунгнам, Гјонгсан, Кореја, а методе су спроведене у складу са смерницама Етичког комитета Универзитета Јеунгнам.
Експерименти инкубације јаја су спроведени коришћењем утврђених процедура43. Да би се проценила стопа излегања (HR), одрасле нематоде старе један дан (приближно 100 женки и 100 мужјака) су пребачене у Петријеве шоље које су садржале гљивицу и остављене су да расту 24 сата. Јаја су затим изолована и третирана 5-јодоиндолом (0,05 mM и 0,1 mM) или авермектином (10 μg/ml) као суспензија у стерилној дестилованој води. Ове суспензије (500 μl; приближно 100 јаја) су пребачене у бунариће плоче за културу ткива са 24 бунарића и инкубиране на 22 °C. Бројање L2 је вршено након 24 сата инкубације, али су сматране мртвим ако се ћелије нису померале када су стимулисане фином платинастом жицом. Овај експеримент је спроведен у две фазе, свака са шест понављања. Подаци из оба експеримента су комбиновани и представљени. Проценат HR је израчунат на следећи начин:
Морталитет ларви је процењен коришћењем претходно развијених процедура. Јаја нематода су сакупљена, а ембриони су синхронизовани излегањем у стерилној дестилованој води да би се генерисале ларве стадијума L2. Синхронизоване ларве (приближно 500 нематода) су третиране 5-јодоиндолом (0,05 mM и 0,1 mM) или авермектином (10 μg/ml) и гајене на Петријевим плочама B. cinerea. Након 48 сати инкубације на 22 °C, нематоде су сакупљене у стерилној дестилованој води и испитане на присуство стадијума L2, L3 и L4. Присуство стадијума L3 и L4 указивало је на трансформацију ларве, док присуство стадијума L2 није указивало на трансформацију. Слике су снимљене коришћењем iRiS™ дигиталног система за снимање ћелија. Овај експеримент је спроведен у две фазе, свака са шест понављања. Подаци из оба експеримента су комбиновани и представљени.
Токсичност 5-јодоиндола и авермектина за семе је процењена коришћењем тестова клијавости на плочама са Мурашиге и Скуг агаром.62 Семе B. oleracea и R. raphanistrum је прво натопљено у стерилној дестилованој води један дан, испрано са 1 мл 100% етанола, стерилисано са 1 мл 50% комерцијалног избељивача (3% натријум хипохлорит) током 15 минута и испрано пет пута са 1 мл стерилне воде. Стерилисано семе је затим пресовано на плоче са агаром за клијање које садрже 0,86 г/л (0,2X) Мурашиге и Скуг медијума и 0,7% бактериолошког агара са или без 5-јодоиндола или авермектина. Плоче су затим инкубиране на 22 °C, а слике су снимљене након 3 дана инкубације. Овај експеримент је спроведен у две фазе, од којих је свака имала шест понављања.
Време објаве: 26. фебруар 2025.