Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену CSS подршку. За најбоље резултате, препоручујемо вам да користите новију верзију прегледача (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказујемо сајт без стилизовања или JavaScript-а.
Откриће и корисна употреба природних производа могу помоћи у побољшању људског живота. Хемикалије које инхибирају раст биљака се широко користе као хербициди за сузбијање корова. Због потребе за употребом различитих врста хербицида, потребно је идентификовати једињења са новим механизмима деловања. У овој студији, открили смо ново једињење N-алкоксипирола, кумамонамид, из Streptomyces werraensis MK493-CF1 и успоставили комплетан процес синтезе. Кроз тестове биолошке активности, открили смо да је урс-моноаминска киселина синтетички интермедијер урс-моноамида и потенцијални...инхибитор раста биљакаПоред тога, развили смо различите деривате урбенонске киселине, укључујући урбенилокси дериват (UDA), који има високу хербицидну активност без негативног утицаја на раст HeLa ћелија. Такође смо открили да деривати урмотонске киселине ометају биљне микротубуле; поред тога, KAND утиче на актинске филаменте и индукује ћелијску смрт; Ови вишеструки ефекти се разликују од ефеката познатих инхибитора микротубула и указују на нови механизам деловања урсонске киселине, што представља важну предност у развоју нових хербицида.
Откриће и практична примена корисних природних производа и њихових деривата је средство за побољшање квалитета људског живота. Секундарни метаболити које производе микроорганизми, биљке и инсекти довели су до великог напретка у медицини и пољопривреди. Многи антибиотици и лекови против леукемије развијени су из природних производа. Поред тога, разне врсте...пестицидиФунгициди и хербициди се екстрахују из ових природних производа за употребу у пољопривреди. Конкретно, хербициди за сузбијање корова су важни алати за повећање приноса усева у савременој пољопривреди, а различите врсте једињења се већ комерцијално користе. Неколико ћелијских процеса у биљкама, као што су фотосинтеза, метаболизам аминокиселина, синтеза ћелијског зида, регулација митозе, сигнализација фитохормона или синтеза протеина, сматрају се типичним метама хербицида. Једињења која инхибирају функцију микротубула су уобичајена класа хербицида који утичу на раст биљака тако што утичу на митотску регулацију2.
Микротубуле су компоненте цитоскелета и широко су конзервиране у еукариотским ћелијама. Хетеродимер тубулина састоји се од α-тубулина и β-тубулина који формирају линеарне протофиламенте микротубула, са 13 протофиламената који формирају цилиндричну структуру. Микротубуле играју вишеструке улоге у биљним ћелијама, укључујући одређивање облика ћелија, ћелијске деобе и интрацелуларног транспорта3,4. Биљне ћелије садрже микротубуле испод интерфазне плазма мембране, а сматра се да ове такозване кортикалне микротубуле контролишу организацију целулозних микрофибрила кроз регулацију комплекса целулозне синтазе4,5. Кортикалне микротубуле ћелија коренског епидермиса, присутне у зони брзог издуживања врха корена, налазе се латерално, а целулозна микровлакна прате ове микротубуле и ограничавају смер ширења ћелија, чиме подстичу анизотропно издуживање ћелија. Стога је функција микротубула уско повезана са морфологијом биљака. Супституције аминокиселина у генима који кодирају тубулин узрокују искривљење низова кортикалних микротубула и раст на леву или десну страну код Arabidopsis 6,7. Слично томе, мутације у протеинима повезаним са микротубулама које регулишу динамику микротубула такође могу довести до искривљеног раста корена8,9,10,11,12,13. Поред тога, третман хербицидима који ометају микротубуле, као што је дизопирамид, познат и као претилахлор, такође узрокује коси раст корена у левој страни14. Ови подаци указују на то да је прецизна регулација функције микротубула кључна за одређивање правца раста биљака.
Откривене су различите врсте инхибитора микротубула, а ови лекови су дали значајан допринос истраживањима цитоскелета, као и пољопривреди и медицини2. Конкретно, оризалин, једињења динитроанилина, дизопирамид, једињења сродна бензамиду и њихови аналози могу инхибирати функцију микротубула и тиме инхибирати раст биљака. Стога се широко користе као хербициди. Међутим, пошто су микротубуле важна компонента биљних и животињских ћелија, већина инхибитора микротубула је цитотоксична за оба типа ћелија. Стога, упркос њиховој признатој корисности као хербицида, ограничен број антимикротубулних средстава се користи у практичне сврхе.
Стрептомицес је род породице Стрептомицес, који обухвата аеробне, грам-позитивне, филаментозне бактерије и широко је познат по својој способности да производи широк спектар секундарних метаболита. Стога се сматра једним од најважнијих извора нових биолошки активних природних производа. У тренутној студији открили смо ново једињење названо кумамонамид, које је изоловано из Стрептомицес верраенсис МК493-ЦФ1 и С. верраенсис ИСП 5486. Користећи спектралну анализу и потпуну спектралну анализу, окарактерисана је структура кумамонамида и одређен је његов јединствени Н-алкоксипиролни скелет. синтеза. Утврђено је да урсмонска киселина, синтетички интермедијер урсмоноамида и његових деривата, инхибира раст и клијање популарне модел биљке Arabidopsis thaliana. У студији односа структуре и активности, открили смо да једињење са Ц9 модификованим у урсонску киселину, названо нонилокси дериват урсонске киселине (KAND), значајно појачава инхибиторни ефекат на раст и клијање. Приметно је да је новооткривени инхибитор раста биљака такође утицао на раст дувана и јетрењаче и није био цитотоксичан за бактерије или HeLa ћелије. Штавише, неки деривати урматонске киселине индукују искривљени фенотип корена, што имплицира да ови деривати директно или индиректно утичу на микротубуле. У складу са овом идејом, наша запажања микротубула обележених имунохистохемијски или флуоресцентним протеинима указују на то да KAND третман деполимеризује микротубуле. Поред тога, третман дериватима кумамотонске киселине пореметио је актинске микрофиламенте. Стога смо открили нови инхибитор раста биљака чији јединствени механизам деловања укључује уништавање цитоскелета.
Сој MK493-CF1 је изолован из земљишта у Шинагава-куу, Токио. Сој MK493-CF1 је формирао добро разгранат стромални мицелијум. Одређена је делимична секвенца 16S рибозомског РНК гена (1422 bp). Овај сој је веома сличан S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: типичан сој, 99,93%). На основу овог резултата, утврђено је да је овај сој уско повезан са типским сојем S. werraensis. Стога смо овај сој привремено назвали S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T такође производи иста биоактивна једињења. Пошто је било мало раних истраживања о добијању природних производа из овог микроорганизма, спроведена су даља хемијска истраживања. Након култивације S. werraensis MK493-CF1 на јечменом медијуму ферментацијом у чврстом стању на 30°C током 14 дана, медијум је екстрахован са 50% EtOH. 60 ml узорка је осушено да би се добило 59,5 mg сировог екстракта. Сирови екстракт је подвргнут HPLC-у са обрнутом фазом да би се добио N-метокси-1H-пирол-2-карбоксамид (1, назван кумамонамид, 36,0 mg). Укупна количина 1 је приближно 60% сировог екстракта. Стога смо одлучили да детаљно проучимо својства кумамотоамида 1.
Кумамонамид 1 је бели аморфни прах, а масена спектрометрија високе резолуције (HRESIMS) потврђује C6H8N2O2 (Сл. 1). C2-супституисани пиролни фрагмент овог једињења карактерише се са δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH у 1H NMR спектру: 4,5 Hz, H-5) и δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), а 13C NMR спектар показује присуство четири sp2 атома угљеника. Присуство амидне групе на C2 позицији процењено је HMBC корелацијом од C-3 протона до амидног карбонилног угљеника при δC 161,1. Поред тога, врхови 1H и 13C NMR спектроскопије на δH 4,10 (3H, S) и δC 68,3 указују на присуство N-метокси група у молекулу. Иако тачан положај метокси групе још није био одређен спектроскопском анализом као што је појачана диференцијална спектроскопија и нуклеарна Оверхаусерова скраћеница (NOEDF), N-метокси-1H-пирол-2-карбоксамид је постао прво једињење кандидат.
Да би се одредила исправна структура једињења 1, извршена је тотална синтеза (Сл. 2а). Третман комерцијално доступног 2-аминопиридина 2 са m-CPBA резултирао је одговарајућим N-оксидом 3 у квантитативном приносу. Након 2-аминоазидације једињења 2, реакција циклокондензације коју је описао Абрамович спроведена је у бензену на 90°C да би се добио жељени 1-хидрокси-1H-пирол-2-карбонитрил 5 у грамима. Брзина 60% (две фазе). 15,16. Метилација и хидролиза једињења 4 затим су дале 1-метокси-1H-пирол-2-карбоксилну киселину (названу „кумотонска киселина“, 6) у добром приносу (70%, два корака). Коначно, амидација преко међупроизвода хлорида киселине 6 коришћењем воденог амонијака дала је Кумамото амид 1 у приносу од 98%. Сви спектрални подаци синтетисаног једињења 1 били су слични изолованом једињењу 1, тако да је одређена структура 1;
Општа синтеза и анализа биолошке активности урбенамида и урбенске киселине. (а) Укупна синтеза Кумамото амида. (б) Седам дана старе саднице дивљег типа Arabidopsis Columbia (Col) гајене су на Murashige и Skoog (MS) плочама које су садржале кумамонамид 6 или кумамонамид 1 у назначеним концентрацијама. Скала = 1 цм.
Прво, проценили смо биолошке активности урбенамида и његових интермедијера у погледу њихове способности да модулирају раст биљака. Додали смо различите концентрације урсмонамида 1 или урсмонске киселине 6 у MS агар медијум и култивисали саднице Arabidopsis thaliana на овом медијуму. Ови тестови су показали да високе концентрације (500 μM) 6 инхибирају раст корена (Сл. 2б). Затим, генерисали смо различите деривате супституцијом N1 позиције 6 и спровели студије односа структуре и активности на њима (процес синтезе аналога је описан у Додатним информацијама (SI)). Саднице Arabidopsis су гајене на медијуму који садржи 50 μM деривата урсонове киселине, а дужина корена је мерена, као што је приказано на слици. Као што је приказано на сликама 3а, б и S1, кумамо киселине имају различите дужине линеарних алкокси ланаца (9, 10, 11, 12 и 13) или великих алкокси ланаца (15, 16 и 17) на N1 позицији. Деривати су показали значајну инхибицију раста корена. Поред тога, открили смо да је примена 200 μM 10, 11 или 17 инхибирала клијање (слике 3ц и S2).
Студија односа структуре и активности Кумамото амида и сродних једињења. (а) Структура и шема синтезе аналога. (б) Квантификација дужине корена садница старих 7 дана узгајаних на MS медијуму са или без 50 μM деривата кумамонамида. Звездице означавају значајне разлике у односу на лажни третман (t-тест, p< 0,05). n>18. Подаци су приказани као средња вредност ± SD. nt значи „није тестирано“ јер више од 50% семена није клијало. (c) Квантификација стопе клијања третираног семена инкубираног 7 дана у MS медијуму са или без 200 μM кумамонамида и сродних једињења. Звездице означавају значајне разлике у односу на лажни третман (хи-квадрат тест). n=96.
Занимљиво је да је додавање алкилних бочних ланаца дужих од C9 смањило инхибиторну активност, што сугерише да једињења повезана са кумамотичком киселином захтевају бочне ланце одређене величине да би показала своју биолошку активност.
Пошто је анализа односа структуре и активности показала да је C9 модификован у урсонску киселину и да је нонилокси дериват урсонске киселине (у даљем тексту KAND 11) био најефикаснији инхибитор раста биљака, спровели смо детаљнију карактеризацију KAND 11. Третман Arabidopsis са 50 μM KAND 11 скоро потпуно је спречио клијање, док су ниже концентрације (40, 30, 20 или 10 μM) KAND 11 инхибирале раст корена на начин зависан од дозе (Сл. 4а, б). Да бисмо тестирали да ли KAND 11 утиче на одрживост коренског меристема, испитали смо коренске меристеме обојене пропидијум јодидом (PI) и мерили величину површине меристема. Величина меристема садница узгајаних на медијуму који садржи 25 μM KAND-11 била је 151,1 ± 32,5 μm, док је величина меристема садница узгајаних на контролном медијуму који садржи DMSO била 264,7 ± 30,8 μm (Сл. 4ц, д), што указује да KAND-11 обнавља ћелијску активност. ширење. Коренски меристем. У складу са овим, третман са KAND 11 смањио је количину сигнала маркера ћелијске деобе CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS у коренском меристему (Сл. 4е) 17. Ови резултати указују да KAND 11 инхибира раст корена смањењем активности ћелијске пролиферације.
Анализа инхибиторног ефекта деривата урбенонске киселине (урбенилокси деривата) на раст. (а) Саднице дивљег типа Col старе 7 дана узгајане на MS плочама са назначеним концентрацијама KAND 11. Скала = 1 цм. (б) Квантификација дужине корена. Слова означавају значајне разлике (Тукијев HSD тест, p< 0,05). n>16. Подаци су приказани као средња вредност ± SD. (ц) Конфокална микроскопија корена дивљег типа Col обојених пропидијум јодидом, узгајаних на MS плочама са или без 25 μM KAND 11. Беле заграде означавају коренски меристем. Скала = 100 µm. (д) Квантификација величине коренског меристема (н = 10 до 11). Статистичке разлике су одређене т-тестом (p< 0,05). Стубићи представљају просечну величину меристема. (е) Диференцијална интерферентна контрастна (DIC) микроскопија коренског меристема који садржи CDKB2 конструкцију; 1pro: CDKB2; 1-GUS обојено и обојено на садницама старим 5 дана узгајаним на MS плочама са или без 25 µM KAND теста.
Фитотоксичност KAND 11 је даље тестирана коришћењем друге дикотиледоне биљке, дувана (Nicotiana tabacum), и главног модел организма копнене биљке, јетрењаче (Marchantia polymorpha). Као и у случају Arabidopsis, саднице дувана SR-1 узгајане на медијуму који садржи 25 μM KAND 11 произвеле су краће корене (Сл. 5а). Поред тога, 40 од 48 семена је клијало на плочама које су садржале 200 μM KAND 11, док је свих 48 семена клијало на медијуму третираном лажно, што указује да су веће концентрације KAND биле значајне (p< 0,05; хи тест - квадрат) инхибирао је клијање дувана. (Сл. 5б). Поред тога, концентрација KAND 11 која је инхибирала раст бактерија у јетреници била је слична ефективној концентрацији у Arabidopsis (Сл. 5ц). Ови резултати указују да KAND 11 може инхибирати раст разних биљака. Затим смо истражили могућу цитотоксичност једињења повезаних са моноамидима медведа у другим организмима, наиме људским HeLa ћелијама и соју Escherichia coli DH5α, као представницима виших животињских и бактеријских ћелија, респективно. У серији тестова ћелијске пролиферације, приметили смо да кумамонамид 1, кумамонамидна киселина 6 и KAND 11 нису утицали на раст HeLa или E. coli ћелија у концентрацијама од 100 μM (Сл. 5д,е).
Инхибиција раста KAND 11 код организама који нису Arabidopsis. (а) Двонедељне саднице дувана дивљег типа SR-1 гајене су на вертикално постављеним MS плочама које су садржале 25 μM KAND 11. (б) Двонедељне саднице дувана дивљег типа SR-1 гајене су на хоризонтално постављеним MS плочама које су садржале 200 μM KAND 11. (ц) Двонедељни пупољци јетрене дрвета дивљег типа Tak-1 гајени на Gamborg B5 плочама са назначеним концентрацијама KAND 11. Црвене стрелице означавају споре које су престале да расту у року од две недеље инкубационог периода. (д) Тест ћелијске пролиферације HeLa ћелија. Број одрживих ћелија мерен је у фиксним временским интервалима коришћењем комплета за бројање ћелија 8 (Dojindo). Као контрола, HeLa ћелије су третиране са 5 μг/мл актиномицина D (Act D), који инхибира транскрипцију РНК полимеразе и изазива ћелијску смрт. Анализе су извршене у три примерка. (е) Тест ћелијске пролиферације E. coli. Раст E. coli је анализиран мерењем OD600. Као контрола, ћелије су третиране са 50 μг/мл ампицилина (Amp), који инхибира синтезу ћелијског зида бактерија. Анализе су спроведене у три примерка.
Да бисмо дешифровали механизам деловања цитотоксичности изазване једињењима сродним урамиду, поново смо анализирали деривате урбенске киселине са умереним инхибиторним ефектима, као што је приказано на слици. Као што је приказано на сликама 2б, 6а, саднице узгајане на агар плочама које садрже високе концентрације (200 μM) урмотонске киселине 6 произвеле су краће и лево закривљено корење (θ = – 23,7 ± 6,1), док су саднице узгајане на контролној подлози произвеле скоро право корење (θ = – 3,8 ± 7,1). Познато је да је овај карактеристичан коси раст резултат дисфункције кортикалних микротубула14,18. У складу са овим налазом, лекови који дестабилизују микротубуле, дизопирамид и оризалин, изазвали су слично нагињање корена под нашим условима раста (слике 2б, 6а). Истовремено, тестирали смо деривате урмотонске киселине и одабрали неколико њих који су, при одређеним концентрацијама, изазвали коси раст корена. Једињења 8, 9 и 15 су променила смер раста корена при 75 μM, 50 μM и 40 μM, респективно, што указује да ова једињења могу ефикасно дестабилизовати микротубуле (Сл. 2б, 6а). Такође смо тестирали најпотентнији дериват урсолне киселине, KAND 11, при нижој концентрацији (15 µM) и открили да примена KAND 11 инхибира раст корена и да је смер раста корена неуједначен, иако има тенденцију да се нагиње улево (Слика C3). Пошто веће концентрације лекова који дестабилизују микротубуле понекад инхибирају раст биљака уместо да изазивају нагињање корена, накнадно смо проценили могућност да KAND 11 утиче на микротубуле посматрајући кортикалне микротубуле у епидермалним ћелијама корена. Имунохистохемија коришћењем анти-β-тубулин антитела у епидермалним ћелијама корена садница третираних са 25 μM KAND 11 показала је нестанак скоро свих кортикалних микротубула у епидермалним ћелијама у зони елонгације (Сл. 6б). Ови резултати указују да кумамотонска киселина и њени деривати делују директно или индиректно на микротубуле како би их пореметили и да су ова једињења нови инхибитори микротубула.
Урсонска киселина и њени деривати мењају кортикалне микротубуле код Arabidopsis thaliana. (а) Угао нагиба корена измерен у присуству различитих деривата урмотонске киселине у назначеним концентрацијама. Такође су анализирани ефекти два једињења за која се зна да инхибирају микротубуле: дизопирамида и оризалина. Уметнути део приказује стандард који се користи за мерење угла раста корена. Звездице означавају значајне разлике у односу на лажни третман (t-тест, p< 0,05). n>19. Скала = 1 цм. (б) Кортикалне микротубуле у епидермалним ћелијама у зони елонгације. Микротубуле у корену дивљег типа Arabidopsis Col узгајаног на MS плочама са или без 25 μM KAND 11 визуализоване су имунохистохемијским бојењем коришћењем примарних антитела на β-тубулин и секундарних антитела конјугираних са Alexa Fluor. Скала = 10 µм. (ц) Митотска структура микротубула у меристему корена. Митотске структуре, укључујући профазне зоне, вретена и фрагмопласте, бројане су са конфокалних слика. Стрелице означавају митотске структуре микротубула. Звездице означавају значајне разлике у односу на лажни третман (t-тест, p< 0,05). n>9. Скала = 50 µm.
Иако Урса има способност да поремети функцију микротубула, очекује се да ће њен механизам деловања бити другачији од типичних средстава за деполимеризацију микротубула. На пример, веће концентрације средстава за деполимеризацију микротубула, као што су дизопирамид и оризалин, индукују анизотропну експанзију епидермалних ћелија, док KAND 11 то не чини. Поред тога, копримена KAND 11 и дизопирамида резултирала је комбинованим одговором раста корена изазваним дизопирамидом и примећена је инхибиција раста изазвана KAND 11 (слика S4). Такође смо анализирали одговор хиперсензитивног мутанта дизопирамида 1-1 (phs1-1) на KAND 11. phs1-1 има неканонску тачкасту мутацију тубулин киназе и производи краће корене када се третира дизопирамидом9,20. Саднице мутанта phs1-1 узгајане на агар медијуму који садржи KAND 11 имале су краће корене сличне онима узгајаним на дизопирамиду (слика S5).
Поред тога, уочили смо структуре митотских микротубула, као што су профазне зоне, вретена и фрагмопласти, у коренском меристему садница третираних са KAND 11. У складу са запажањима за CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, примећено је значајно смањење броја митотских микротубула (Сл. .6ц).
Да бисмо окарактерисали цитотоксичност KAND 11 при субћелијској резолуцији, третирали смо суспензионе ћелије дувана BY-2 са KAND 11 и посматрали њихов одговор. Прво смо додали KAND 11 ћелијама BY-2 које експримирају TagRFP-TUA6, који флуоресцентно обележава микротубуле, како бисмо проценили ефекат KAND 11 на кортикалне микротубуле. Густина кортикалних микротубула процењена је анализом слике, која је квантификовала проценат цитоскелетних пиксела међу цитоплазматским пикселима. Резултати теста су показали да је након третмана са 50 μM или 100 μM KAND 11 током 1 сата, густина значајно смањена на 0,94 ± 0,74% или 0,23 ± 0,28%, респективно, док је густина ћелија третираних DMSO износила 1,61 ± 0,34% (Слика 7а). Ови резултати су у складу са запажањем код Arabidopsis да третман KAND 11 индукује деполимеризацију кортикалних микротубула (Слика 6б). Такође смо испитали BY-2 линију са GFP-ABD-обележеним актинским филаментима након третмана истом концентрацијом KAND 11 и приметили да је третман KAND 11 пореметио актинске филаменте. Третман са 50 μM или 100 μM KAND 11 током 1 сата значајно је смањио густину актинских филамената на 1,20 ± 0,62% односно 0,61 ± 0,26%, респективно, док је густина у ћелијама третираним DMSO била 1,69 ± 0,51% (Слика 2). 7б). Ови резултати су у супротности са ефектима пропизамида, који не утиче на актинске филаменте, и латрункулина Б, деполимеризатора актина који не утиче на микротубуле (SI слика S6). Поред тога, третман кумамонамидом 1, кумамонамидном киселином 6 или KAND 11 није утицао на микротубуле у HeLa ћелијама (SI слика S7). Стога се сматра да је механизам деловања KAND 11 другачији од механизма познатих ометача цитоскелета. Поред тога, наше микроскопско посматрање BY-2 ћелија третираних са KAND 11 открило је почетак ћелијске смрти током третмана KAND 11 и показало да се удео мртвих ћелија обојених Еванс плавом бојом није значајно повећао након 30 минута третмана KAND 11, док се након 90 минута третмана са 50 μM или 100 μM KAND број мртвих ћелија повећао на 43,7% односно 80,1%, респективно (Слика 7ц). Узети заједно, ови подаци указују да је нови дериват урсолне киселине KAND 11 биљно-специфичан инхибитор цитоскелета са раније непознатим механизмом деловања.
KAND утиче на кортикалне микротубуле, актинске филаменте и виталност BY-2 ћелија дувана. (а) Визуализација кортикалних микротубула у BY-2 ћелијама у присуству TagRFP-TUA6. BY-2 ћелије третиране са KAND 11 (50 μM или 100 μM) или DMSO испитане су конфокалном микроскопијом. Густина кортикалних микротубула израчуната је из микрографија 25 независних ћелија. Слова означавају значајне разлике (Tukey HSD тест, p< 0,05). Скала = 10 µм. (б) Кортикални актински филаменти у BY-2 ћелијама визуелизовани у присуству GFP-ABD2. BY-2 ћелије третиране са KAND 11 (50 μM или 100 μM) или DMSO испитане су конфокалном микроскопијом. Густина кортикалних актинских филамената израчуната је из микрографија 25 независних ћелија. Слова означавају значајне разлике (Tukey HSD тест, p< 0,05). Скала = 10 µm. (c) Посматрање мртвих BY-2 ћелија бојењем Еванс плавим. BY-2 ћелије третиране са KAND 11 (50 μM или 100 μM) или DMSO испитане су микроскопијом светлог поља. n=3. Скала = 100 µm.
Откриће и примена нових природних производа довели су до значајног напретка у различитим аспектима људског живота, укључујући медицину и пољопривреду. Спроведена су историјска истраживања како би се добила корисна једињења из природних ресурса. Конкретно, актиномицете су познате као корисне као антипаразитски антибиотици за нематоде због своје способности да производе различите секундарне метаболите као што су авермектин, водеће једињење ивермектина и блеомицин и његови деривати, који се медицински користе као средство против рака21,22. Слично томе, откривена су разна хербицидна једињења из актиномицета, од којих се нека већ комерцијално користе1,23. Стога се анализа метаболита актиномицета ради изоловања природних производа са жељеним биолошким активностима сматра ефикасном стратегијом. У овој студији, открили смо ново једињење, кумамонамид, из S. werraensis и успешно га синтетизовали. Урсонска киселина је синтетички интермедијер урбенамида и његових деривата. Може изазвати карактеристично увијање корена, показати умерену до јаку хербицидну активност и директно или индиректно оштетити биљне микротубуле. Међутим, механизам деловања урмотонске киселине може се разликовати од механизма постојећих инхибитора микротубула, јер KAND 11 такође омета актинске филаменте и изазива ћелијску смрт, што сугерише регулаторни механизам којим урмотонска киселина и њени деривати утичу на широк спектар цитоскелетних структура.
Даља детаљна карактеризација урбенонске киселине помоћи ће бољем разумевању механизма деловања урбенонске киселине. Конкретно, следећи циљ је процена способности урсoнске киселине да се веже за редуковане микротубуле како би се утврдило да ли урсoнска киселина и њени деривати делују директно на микротубуле и деполимеризују их, или њихово дејство доводи до дестабилизације микротубула. Поред тога, у случају када микротубуле нису директна мета, идентификовање места деловања и молекуларних мета урсoнске киселине на биљним ћелијама помоћи ће даљем разумевању својстава сродних једињења и могућих начина за побољшање хербицидне активности. Наш тест биоактивности открио је јединствену цитотоксичну способност урсoнске киселине на раст биљака као што су Arabidopsis thaliana, дуван и јетрена грмља, док ни ћелије E. coli ни HeLa нису биле погођене. Мала или никаква токсичност за животињске ћелије је предност деривата урсoнске киселине ако се развију као хербициди за употребу на отвореним пољопривредним пољима. Заиста, пошто су микротубуле уобичајене структуре код еукариота, њихова селективна инхибиција у биљкама је кључни захтев за хербициде. На пример, пропизамид, средство за деполимеризацију микротубула које се директно везује за тубулин и инхибира полимеризацију, користи се као хербицид због своје ниске токсичности за животињске ћелије24. За разлику од дизопирамида, сродни бензамиди имају различите циљне специфичности. Поред биљних микротубула, RH-4032 или бензоксамид такође инхибира микротубуле животињских ћелија или оомицета, респективно, а залиламид се користи као фунгицид због своје ниске фитотоксичности25,26,27. Новооткривени медвед и његови деривати показују селективну цитотоксичност против биљака, али вреди напоменути да даље модификације могу променити њихову циљну специфичност, потенцијално пружајући додатне деривате за контролу патогених гљивица или оомицета.
Јединствена својства урбенске киселине и њених деривата корисна су за њихов развој као хербицида и употребу као истраживачких алата. Значај цитоскелета у контроли облика биљних ћелија је широко препознат. Раније студије су показале да су биљке развиле сложене механизме организације кортикалних микротубула контролишући динамику микротубула како би правилно контролисале морфогенезу. Идентификован је велики број молекула одговорних за регулацију активности микротубула, а истраживања у вези са тим су још увек у току3,4,28. Наше тренутно разумевање динамике микротубула у биљним ћелијама не објашњава у потпуности механизме организације кортикалних микротубула. На пример, иако и дизопирамид и оризалин могу деполимеризовати микротубуле, дизопирамид изазива озбиљно изобличење корена, док оризалин има релативно благ ефекат. Штавише, мутације у тубулину, који стабилизује микротубуле, такође изазивају декстроротацију у корену, док паклитаксел, који такође стабилизује динамику микротубула, то не чини. Стога би проучавање и идентификација молекуларних мета урсолне киселине требало да пружи нове увиде у регулацију биљних кортикалних микротубула. Исто тако, будућа поређења хемикалија које су ефикасне у подстицању искривљеног раста, као што је дизопирамид, и мање ефикасних хемикалија, као што су оризалин или кумамоторна киселина, пружиће назнаке о томе како се искривљени раст дешава.
С друге стране, преуређења цитоскелета повезана са одбраном су још једна могућност за објашњење цитотоксичности урсoнске киселине. Инфекција патогеном или уношење елиситора у биљне ћелије понекад узрокује уништење цитоскелета и накнадну ћелијску смрт29. На пример, објављено је да криптоксантин изведен из оомицета поремећује микротубуле и актинске филаменте пре смрти ћелија дувана, слично ономе што се дешава код KAND третмана30,31. Сличности између одбрамбених одговора и ћелијских одговора изазваних урсoнском киселином навеле су нас на хипотезу да они покрећу уобичајене ћелијске процесе, иако је евидентан бржи и јачи ефекат урсoнске киселине него криптоксантина. Међутим, студије су показале да поремећај актинских филамената подстиче спонтану ћелијску смрт, што није увек праћено поремећајем микротубула29. Поред тога, остаје да се види да ли патоген или елиситор изазивају искривљени раст корена, као што то чине деривати урсoнске киселине. Стога је молекуларно знање које повезује одбрамбене одговоре и цитоскелет атрактиван проблем који треба решити. Искоришћавањем присуства једињења мале молекулске тежине сродних урсoнској киселини, као и низа деривата са различитим јачинама деловања, они могу пружити могућности за циљање непознатих ћелијских механизама.
Узето заједно, откриће и примена нових једињења која модулирају динамику микротубула пружиће моћне методе за решавање сложених молекуларних механизама који леже у основи одређивања облика биљних ћелија. У овом контексту, недавно развијено једињење урматонска киселина, која утиче на микротубуле и актинске филаменте и индукује ћелијску смрт, може пружити прилику да се дешифрује веза између контроле микротубула и ових других механизама. Стога ће нам хемијска и биолошка анализа коришћењем урбенонске киселине помоћи да разумемо молекуларне регулаторне механизме који контролишу цитоскелет биљака.
Инокулирати S. werraensis MK493-CF1 у Ерленмајерову боцу са преградама од 500 мл која садржи 110 мл подлоге за семе која се састоји од 2% (w/v) галактозе, 2% (w/v) пасте есенције, 1% (w/v) Bacto састава.-сојтон (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) екстракта кукуруза (KOGOSTCH Co., Ltd., Јапан), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 и 0,2% CaCO3 у дејонизованој води. (pH 7,4 пре стерилизације). Културе семена су инкубиране на ротационој мућкалици (180 о/мин) на 27°C током 2 дана. Производна култивација путем ферментације у чврстом стању. Семе културе (7 мл) је пренето у К-1 боцу од 500 мл која садржи 40 г производне подлоге која се састоји од 15 г пресованог јечма (MUSO Co., Ltd., Јапан) и 25 г дејонизоване воде (pH није подешен пре стерилизације). Ферментација је спроведена на 30°C у мраку током 14 дана. Ферментациони материјал је екстрахован са 40 мл/боца EtOH и центрифугиран (1500 г, 4°C, 10 мин). Супернатант културе (60 мл) је екстрахован смешом 10% MeOH/EtOAc. Органски слој је испарен под сниженим притиском да би се добио остатак (59,5 мг), који је подвргнут ХПЛЦ-у са градијентном елуацијом (0–10 минута: 90%) на колони са обрнутом фазом (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ИД 10 мм × дужина 250 мм) H2O/CH3CN, 10–35 минута: 90% H2O/CH3CN до 70% H2O/CH3CN (градијент), 35–45 минута: 90% H2O/EtOH, 45–155 минута: 90% H2O/EtOH до 100% EtOH (градијент (градијент), 155–200 мин: 100% EtOH) при брзини протока од 1,5 мл/мин, кумамонамид (1, 36,0 мг) је изолован као бели аморфни прах.
Кумамотоамид(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ израчуната вредност: 141,0659, измерена вредност: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Семе врсте Columbia (Col-0) је добијено из Центра за биолошке ресурсе Arabidopsis (ABRC) уз дозволу за истраживачку употребу. Семе врсте Col-0 је размножавано и одржавано у нашим лабораторијским условима и коришћено је као биљке дивљег типа Arabidopsis. Семе Arabidopsis је површински стерилисано и култивисано у подлози Мурашиге и Скуг упола јачине која садржи 2% сахарозе (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-морфолино)етансулфонске киселине (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). и 1,5% агара (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, на 23 °C и константној светлости. Семе мутанта phs1-1 је обезбедио Т. Хашимото (Нара Институт за науку и технологију).
Семе соја SR-1 је обезбедио Т. Хашимото (Нара Институт за науку и технологију) и коришћено је као дивљи тип биљке дувана. Семе дувана је површински стерилисано и натопљено у стерилној води три ноћи ради подстицања клијања, затим стављено у раствор упола јаче који садржи 2% сахарозе, 0,05% (w/v) MES и 0,8% гелан гуме (Fujifilm Wako Pure Chemical) Мурашиге и Скуг медијум) са pH 5,7 и инкубирано на 23°C под константним светлом.
Сој Так-1 је обезбедио Т. Кохчи (Универзитет у Кјоту) и коришћен је као стандардна експериментална јединица за проучавање јетрењаче. Гема је добијена из стерилисаних култивисаних биљака, а затим је посејана на Gamborg B5 медијум (Fujifilm Wako Pure Chemical) који садржи 1% сахарозе и 0,3% гелан гуме и инкубирана на 23°C под континуираним светлом.
Ћелије дувана BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) обезбедио је С. Хасезава (Универзитет у Токију). BY-2 ћелије су разблажене 95 пута у модификованом Линсмајеровом и Скуговом медијуму и недељно допуњаване 2,4-дихлорофеноксисирћетном киселином 32. Ћелијска суспензија је мешана на ротационом шејкеру при 130 о/мин на 27°C у мраку. Ћелије испрати са 10 пута већом запремином свежег медијума и ресуспендовати у истом медијуму. BY-2 трансгене ћелијске линије које стабилно експресују маркер микротубула TagRFP-TUA6 или маркер актинских филамента GFP-ABD2 под промотором 35S вируса мозаика карфиола генерисане су као што је описано 33,34,35. Ове ћелијске линије могу се одржавати и синхронизовати коришћењем процедура сличних онима које се користе за оригиналну BY-2 ћелијску линију.
HeLa ћелије су култивисане у Дулбековом модификованом Игловом медијуму (DMEM) (Life Technologies) допуњеном са 10% феталног говеђег серума, 1,2 U/ml пеницилина и 1,2 μg/ml стрептомицина у инкубатору на 37°C са 5% CO2.
Сви експерименти описани у овом рукопису изведени су у складу са јапанским прописима и смерницама о биолошкој безбедности.
Једињења су растворена у диметил сулфоксиду (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) као основни раствори и разблажена у MS медијуму за Arabidopsis и дуван или Gamborg B5 медијуму за јетрену дуван. За тест инхибиције раста корена, више од 10 семена по плочи је посејано на агар медијум који садржи назначена једињења или DMSO. Семе је инкубирано у комори за раст током 7 дана. Саднице су фотографисане и измерена је дужина корена. За тест клијања Arabidopsis, 48 семена по плочи је посејано на агар медијум који садржи 200 μM једињења или DMSO. Семе Arabidopsis је гајено у комори за раст и број проклијалих садница је пребројан 7 дана након клијања (dag). За тест клијања дувана, 24 семена по плочи је посејано на агар медијум који садржи 200 μM KAND или DMSO. Семе дувана је гајено у комори за раст и број проклијалих садница је пребројан након 14 дана. За тест инхибиције раста јетрене глисте, 9 ембриона са сваке плоче је постављено на агар медијум који садржи назначене концентрације KAND-а или DMSO-а и инкубирано у комори за раст током 14 дана.
Користити саднице обојене са 5 мг/мл пропидијум јодида (ПИ) да би се визуализовала организација коренског меристема. ПИ сигнали су посматрани флуоресцентном микроскопијом коришћењем TCS SPE конфокалног ласерског скенирајућег микроскопа (Leica Microsystems).
Хистохемијско бојење корена β-глукуронидазом (GUS) је извршено према протоколу који су описали Малами и Бенфеј36. Саднице су фиксиране у 90% ацетону преко ноћи, обојене са 0,5 мг/мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-д-глукуронске киселине у GUS пуферу током 1 сата и стављене у хидратисани раствор хлоралдехида (8 г хлоралхидрата, 2 мл воде и 1 мл глицерола) и посматране диференцијалном интерферентном контрастном микроскопијом коришћењем Axio Imager M1 микроскопа (Carl Zeiss).
Углови корена су мерени на садницама старим 7 дана узгајаним на вертикално постављеним плочама. Измерите угао корена у односу на правца вектора гравитације као што је описано у кораку 6.
Распоред кортикалних микротубула је посматран као што је описано, са мањим изменама протокола 37. Антитело против β-тубулина (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) и анти-мишји IgG коњугован са Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) коришћени су као примарна и секундарна антитела у разблажењима 1:1000 и 1:100, респективно. Флуоресцентне слике су снимљене коришћењем TCS SPE конфокалног ласерског скенирајућег микроскопа (Leica Microsystems). Направите Z-stack слике и креирајте пројекције максималног интензитета према упутствима произвођача.
Тест пролиферације ћелија HeLa је извршен коришћењем комплета за бројање ћелија 8 (Dojindo) према упутствима произвођача.
Раст E. coli DH5α је анализиран мерењем густине ћелија у култури помоћу спектрофотометра на 600 nm (OD600).
Организација цитоскелета у трансгеним BY-2 ћелијама је посматрана коришћењем флуоресцентног микроскопа опремљеног CSU-X1 конфокалним скенирајућим уређајем (Yokogawa) и sCMOS камером (Zyla, Andor Technology). Густина цитоскелета је процењена анализом слике, која је квантификовала проценат пиксела цитоскелета међу цитоплазматским пикселима у конфокалним сликама коришћењем ImageJ софтвера као што је описано38,39.
Да би се детектовала ћелијска смрт у BY-2 ћелијама, аликвот ћелијске суспензије је инкубиран са 0,05% Еванс плавим током 10 минута на собној температури. Селективно бојење мртвих ћелија Еванс плавим зависи од екструзије боје из одрживих ћелија помоћу интактне плазма мембране40. Обојене ћелије су посматране помоћу микроскопа са светлим пољем (BX53, Olympus).
HeLa ћелије су гајене у DMEM медијуму допуњеном са 10% FBS у влажном инкубатору на 37°C и 5% CO2. Ћелије су третиране са 100 μM KAND 11, кумамонаминском киселином 6, кумамонамидом 1, 100 нг/мл колцемида (Gibco) или 100 нг/мл Nocodmaze (Sigma) током 6 сати на 37°C. Ћелије су фиксиране са MetOH током 10 минута, а затим са ацетатом током 5 минута на собној температури. Фиксиране ћелије су инкубиране са примарним антителом β-тубулина (1D4A4, Proteintech: 66240-1) разблаженим у 0,5% BSA/PBS током 2 сата, испране 3 пута са TBST, а затим инкубиране са Alexa Fluor козјим антителом. 488 1 сат. – Мишји IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) и 15 нг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) разблаженог у 0,5% BSA/PBS. Након испирања са TBST три пута, обојене ћелије су посматране на инвертованом микроскопу Nikon Eclipse Ti-E. Слике су снимљене хлађеном Hamamatsu ORCA-R2 CCD камером коришћењем MetaMorph софтвера (Molecular Devices).
Време објаве: 17. јун 2024.