Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Верзија претраживача коју користите има ограничену подршку за ЦСС.За најбоље резултате препоручујемо да користите новију верзију прегледача (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).У међувремену, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказујемо сајт без стила или ЈаваСцрипт-а.
Откриће и корисна употреба природних производа може помоћи у побољшању људског живота.Хемикалије које инхибирају раст биљака се широко користе као хербициди за сузбијање корова.Због потребе употребе различитих врста хербицида, постоји потреба да се идентификују једињења са новим механизмима деловања.У овој студији открили смо ново једињење Н-алкоксипирола, кумамонамид, из Стрептомицес верраенсис МК493-ЦФ1 и успоставили комплетан процес синтезе.Кроз тестове биолошке активности, открили смо да је урс-моноаминска киселина синтетички интермедијер урс-моноамида и потенцијалноинхибитор раста биљака.Поред тога, развили смо различите деривате урбенонске киселине, укључујући дериват урбенилокси (УДА), који има високу хербицидну активност без негативног утицаја на раст ХеЛа ћелија.Такође смо открили да деривати урмотонске киселине ометају микротубуле биљака;поред тога, КАНД утиче на актинске филаменте и индукује ћелијску смрт;Ови вишеструки ефекти се разликују од оних познатих инхибитора микротубула и сугеришу нови механизам деловања урсонске киселине, што представља важну предност у развоју нових хербицида.
Откривање и практична примена корисних природних производа и њихових деривата средство је за побољшање квалитета људског живота.Секундарни метаболити које производе микроорганизми, биљке и инсекти довели су до великог напретка у медицини и пољопривреди.Многи антибиотици и лекови против леукемије развијени су од природних производа.Поред тога, разне врстепестицида, фунгициди и хербициди се екстрахују из ових природних производа за употребу у пољопривреди.Конкретно, хербициди за сузбијање корова су важна средства за повећање приноса усева у савременој пољопривреди, а различите врсте једињења се већ користе комерцијално.Неколико ћелијских процеса у биљкама, као што су фотосинтеза, метаболизам аминокиселина, синтеза ћелијског зида, регулација митозе, сигнализација фитохормона или синтеза протеина, сматрају се типичним метама хербицида.Једињења која инхибирају функцију микротубула су уобичајена класа хербицида који утичу на раст биљака утичући на митотичку регулацију2.
Микротубуле су компоненте цитоскелета и широко су очуване у еукариотским ћелијама.Тубулински хетеродимер се састоји од α-тубулина и β-тубулина који формирају линеарне протофиламенте микротубула, са 13 протофиламената који формирају цилиндричну структуру.Микротубуле играју вишеструке улоге у биљним ћелијама, укључујући одређивање облика ћелије, деобу ћелије и интрацелуларни транспорт3,4.Биљне ћелије садрже микротубуле испод интерфазне плазма мембране, а сматра се да ове такозване кортикалне микротубуле контролишу организацију целулозних микрофибрила кроз регулацију комплекса целулозне синтазе4,5.Кортикалне микротубуле епидермалних ћелија корена, присутне у зони брзог издужења врха корена, лоциране су бочно, а целулозна микровлакна прате ове микротубуле и ограничавају правац ширења ћелије, чиме се промовише анизотропно издуживање ћелија.Стога је функција микротубула уско повезана са морфологијом биљака.Супституције аминокиселина у генима који кодирају тубулин узрокују искривљење низова кортикалних микротубула и раст на левој или десној страни код Арабидопсис 6,7.Слично, мутације у протеинима повезаним са микротубулама који регулишу динамику микротубула такође могу довести до изобличеног раста корена8,9,10,11,12,13.Поред тога, третман хербицидима који ометају микротубуле као што је дизопирамид, такође познат као претилахлор, такође изазива левострани раст косог корена14.Ови подаци указују да је прецизна регулација функције микротубула критична за одређивање правца раста биљака.
Откривене су различите врсте инхибитора микротубула, а ови лекови су дали значајан допринос истраживању цитоскелета, као и пољопривреди и медицини2.Конкретно, оризалин, једињења динитроанилина, дизопирамид, једињења сродна бензамиду и њихови аналози могу инхибирати функцију микротубула и на тај начин инхибирати раст биљака.Због тога се широко користе као хербициди.Међутим, пошто су микротубуле важна компонента биљних и животињских ћелија, већина инхибитора микротубула је цитотоксична за оба типа ћелија.Стога, упркос њиховој признатој употреби као хербициди, ограничен број антимикротубулских агенаса се користи у практичне сврхе.
Стрептомицес је род породице Стрептомицес, који укључује аеробне, грам-позитивне, филаментозне бактерије и надалеко је познат по својој способности да производи широк спектар секундарних метаболита.Због тога се сматра једним од најважнијих извора нових биолошки активних природних производа.У тренутној студији, открили смо ново једињење под називом кумамонамид, које је изоловано из Стрептомицес верраенсис МК493-ЦФ1 и С. верраенсис ИСП 5486. Користећи спектралну анализу и пуну спектралну анализу, окарактерисана је структура кумамонамида и његов јединствени Н-алкоксипирол скелет је одређивана.синтеза.Утврђено је да урсмонска киселина, синтетички интермедијер урсмоноамида и његових деривата, инхибира раст и клијање популарне моделне биљке Арабидопсис тхалиана.У студији односа структуре и активности, открили смо да једињење са Ц9 модификованим у урсонску киселину, названо нонилокси дериват урсонске киселине (КАНД), значајно појачава инхибиторни ефекат на раст и клијање.Приметно је да је новооткривени инхибитор раста биљака такође утицао на раст дувана и јетрењаче и није био цитотоксичан за бактерије или ХеЛа ћелије.Штавише, неки деривати урмотонске киселине изазивају изобличени фенотип корена, што имплицира да ови деривати директно или индиректно утичу на микротубуле.У складу са овом идејом, наша запажања микротубула обележених било имунохистохемијски или флуоресцентним протеинима указују на то да КАНД третман деполимеризује микротубуле.Поред тога, третман дериватима кумамотонске киселине пореметио је актинске микрофиламенте.Тако смо открили нови инхибитор раста биљака чији јединствени механизам деловања укључује уништавање цитоскелета.
Сој МК493-ЦФ1 је изолован из земље у Схинагава-ку, Токио.Сој МК493-ЦФ1 формирао је добро разгранати стромални мицелијум.Одређена је делимична секвенца гена 16С рибозомалне РНК (1422 бп).Овај сој је веома сличан С. верраенсис (НБРЦ 13404Т = ИСП 5486, 1421/1422 бп, Т: типичан сој, 99,93%).На основу овог резултата утврђено је да је овај сој уско повезан са типом соја С. верраенсис.Стога смо овај сој привремено назвали С. верраенсис МК493-ЦФ1.С. верраенсис ИСП 5486Т такође производи иста биоактивна једињења.Пошто је било мало раних истраживања о добијању природних производа од овог микроорганизма, спроведена су даља хемијска истраживања.После култивације С. верраенсис МК493-ЦФ1 на медијуму јечма ферментацијом у чврстом стању на 30°Ц током 14 дана, медијум је екстрахован са 50% ЕтОХ.60 мл узорка је осушено да би се добило 59,5 мг сировог екстракта.Сирови екстракт је подвргнут ХПЛЦ реверзне фазе да би се добио Н-метокси-лХ-пирол-2-карбоксамид (1, назван кумамонамид, 36,0 мг).Укупна количина 1 је приближно 60% сировог екстракта.Због тога смо одлучили да детаљно проучимо својства кумамотоамида 1.
Кумамонамид 1 је бели аморфни прах и масена спектрометрија високе резолуције (ХРЕСИМС) потврђује Ц6Х8Н2О2 (слика 1).Ц2-супституисани фрагмент пирола овог једињења карактерише δХ 6,94 (1Х, т, Ј = 2,8, 4,8 Хз, Х-4), δХ 6,78 (1Х, д, Ј = 2,5, δХ у 1Х НМР спектру: 4,5 Хз , Х-5) и δХ 6,78 (1Х, д, Ј = 2,5 Хз, Х-6), а 13Ц НМР спектар показује присуство четири сп2 атома угљеника.Присуство амидне групе на позицији Ц2 је процењено ХМБЦ корелацијом од Ц-3 протона до амидног карбонилног угљеника на δЦ 161,1.Поред тога, 1Х и 13Ц НМР пикови на δХ 4,10 (3Х, С) и δЦ 68,3 указују на присуство Н-метокси група у молекулу.Иако тачан положај метокси групе још није био одређен спектроскопском анализом као што је спектроскопија побољшане разлике и нуклеарна Оверхаусерова скраћеница (НОЕДФ), Н-метокси-1Х-пирол-2-карбоксамид је постао први кандидат за једињење.
Да би се одредила тачна структура 1, извршена је тотална синтеза (слика 2а).Третман комерцијално доступног 2-аминопиридина 2 са м-ЦПБА резултирао је одговарајућим Н-оксидом 3 у квантитативном приносу.После 2-аминоазидације 2, реакција циклокондензације коју је описао Абрамович изведена је у бензену на 90°Ц да би се добио жељени 1-хидрокси-1Х-пирол-2-карбонитрил 5 у грамима.Брзина 60% (два степена).15,16.Метилацијом и хидролизом 4 је затим добијена 1-метокси-1Х-пирол-2-карбоксилна киселина (названа "кумотонска киселина", 6) са добрим приносом (70%, два корака).Коначно, амидација преко киселинског хлорида интермедијера 6 коришћењем воденог раствора амонијака дала је Кумамото амид 1 у приносу од 98%.Сви спектрални подаци синтетизованог 1 били су слични изолованом 1, па је одређена структура 1;
Општа синтеза и анализа биолошке активности урбенамида и урбенске киселине.(а) Укупна синтеза Кумамото амида.(б) Седмодневне саднице дивљег типа Арабидопсис Цолумбиа (Цол) узгајане су на Мурасхиге и Скоог (МС) плочама које садрже кумамонамид 6 или кумамонамид 1 у назначеним концентрацијама.Скала бар = 1 цм.
Прво смо проценили биолошке активности урбенамида и његових интермедијера због њихове способности да модулишу раст биљака.Додали смо различите концентрације урсмонамида 1 или урсмонске киселине 6 у МС агар медијум и култивисане саднице Арабидопсис тхалиана на овој подлози.Ови тестови су показали да високе концентрације (500 μМ) 6 инхибирају раст корена (слика 2б).Затим смо генерисали различите деривате заменом Н1 позиције од 6 и извршили студије односа структура-активност на њима (процес аналогне синтезе је описан у пратећим информацијама (СИ)).Саднице Арабидопсис узгајане су на медијуму са 50 μМ деривата урсонске киселине и мерена је дужина корена.као што је приказано на слици.Као што је приказано на сликама 3а, б и С1, кумамо киселине имају различите дужине линеарних алкокси ланаца (9, 10, 11, 12 и 13) или великих алкокси ланаца (15, 16 и 17) на позицији Н1.Деривати су показали значајну инхибицију раста корена.Поред тога, открили смо да примена 200 μМ 10, 11 или 17 инхибира клијање (слике 3ц и С2).
Проучавање односа структуре и активности Кумамото амида и сродних једињења.(а) Структура и шема синтезе аналога.(б) Квантификација дужине корена 7-дневних садница узгајаних на МС медијуму са или без 50 μМ деривата кумамонамида.Звездице указују на значајне разлике са лажним третманом (т тест, стр< 0,05).н>18. Подаци су приказани као средња вредност ± СД.нт значи „није тестирано“ јер више од 50% семена није клијало.(ц) Квантификација брзине клијања третираног семена инкубираних 7 дана у МС медијуму са или без 200 μМ кумамонамида и сродних једињења.Звездице указују на значајне разлике са лажним третманом (хи-квадрат тест).н=96.
Занимљиво је да је додавање алкил бочних ланаца дужих од Ц9 смањило инхибиторну активност, што сугерише да једињења везана за кумамотоичну киселину захтевају бочне ланце одређене величине да би испољили своју биолошку активност.
Пошто је анализа односа структуре и активности показала да је Ц9 модификован у урсонску киселину и да је нонилокси дериват урсонске киселине (у даљем тексту КАНД 11) био најефикаснији инхибитор раста биљака, спровели смо детаљнију карактеризацију КАНД 11. Третман Арабидопсис са 50 μМ КАНД 11 је скоро потпуно спречио клијање, док су ниже концентрације (40, 30, 20 или 10 μМ) КАНД 11 инхибирали раст корена на дозно зависан начин (слика 4а, б).Да бисмо тестирали да ли КАНД 11 утиче на одрживост меристема корена, испитали смо меристеме корена обојене пропидијум јодидом (ПИ) и измерили величину површине меристема.Величина меристема садница узгојених на подлози која садржи 25 μМ КАНД-11 износила је 151,1 ± 32,5 μм, док је величина меристема садница узгојених на контролној подлози која садржи ДМСО износила 264,7 ± 30,8 μм (слика 4ц, д) (слика 4ц, д) , што указује да КАНД-11 обнавља ћелијску активност.ширење.Корен меристем.У складу са овим, третман КАНД 11 смањио је количину маркера ћелијске деобе ЦДКБ2;1п::ЦДКБ2;1-ГУС сигнала у меристему корена (слика 4е) 17 .Ови резултати показују да КАНД 11 инхибира раст корена смањујући активност пролиферације ћелија.
Анализа инхибиторног дејства деривата урбенонске киселине (деривати урбенилокси) на раст.(а) 7-дневне саднице дивљег типа Цол узгојене на МС плочама са назначеним концентрацијама КАНД 11. Скала = 1 цм.(б) Квантификација дужине корена.Слова указују на значајне разлике (Тукеи ХСД тест, стр< 0,05).н>16. Подаци су приказани као средња вредност ± СД.(ц) Конфокална микроскопија дивљег типа Цол корена обојених пропидијум јодидом, узгајаних на МС плочама са или без 25 μМ КАНД 11. Беле заграде означавају меристем корена.Скала бар = 100 µм.(д) Квантификација величине меристема корена (н = 10 до 11).Статистичке разлике су одређене коришћењем т-теста (стр< 0,05).Траке представљају просечну величину меристема.(е) Диференцијална интерференција контрастна (ДИЦ) микроскопија меристема корена који садржи конструкт ЦДКБ2;1про: ЦДКБ2;1-ГУС обојен и обојен на 5-дневним садницама узгајаним на МС плочама са или без 25 µМ КАНД теста.
Фитотоксичност КАНД 11 је даље тестирана коришћењем друге дикотиледонске биљке, дувана (Ницотиана табацум), и главног узорка копненог биљног организма, јетрењаче (Марцхантиа полиморпха).Као иу случају Арабидопсис, саднице дувана СР-1 узгајане на подлози од 25 μМ КАНД 11 дале су краће корење (слика 5а).Поред тога, 40 од 48 семена је клијало на плочама које садрже 200 μМ КАНД 11, док је свих 48 семена клијало на лажно третираној подлози, што указује да су веће концентрације КАНД-а биле значајне (п< 0,05;цхи тест -квадрат) инхибирао клијање дувана.(слика 5б).Поред тога, концентрација КАНД 11 која је инхибирала раст бактерија у јетреници била је слична ефективној концентрацији код Арабидопсис (слика 5ц).Ови резултати показују да КАНД 11 може инхибирати раст различитих биљака.Затим смо истражили могућу цитотоксичност једињења повезаних са моноамидом медведа у другим организмима, односно људским ХеЛа ћелијама и Есцхерицхиа цоли соју ДХ5α, као представницима виших животињских и бактеријских ћелија, респективно.У серији тестова пролиферације ћелија, приметили смо да кумамонамид 1, кумамонамидна киселина 6 и КАНД 11 не утичу на раст ћелија ХеЛа или Е. цоли у концентрацијама од 100 μМ (Слика 5д,е).
Инхибиција раста КАНД 11 код не-Арабидопсис организама.(а) Двонедељне саднице дувана дивљег типа СР-1 узгајане су на вертикално постављеним МС плочама које садрже 25 μМ КАНД 11. (б) Двонедељне саднице дувана дивљег типа СР-1 узгајане су на хоризонтално постављеним МС плоче које садрже 200 μМ КАНД 11. (ц) Двонедељни пупољци дивљег типа Так-1 џигерице узгајани на Гамборг Б5 плочама са назначеним концентрацијама КАНД 11. Црвене стрелице показују споре које су престале да расту током двонедељне инкубације раздобље.(д) Тест пролиферације ћелија ХеЛа ћелија.Број живих ћелија је мерен у фиксним временским интервалима коришћењем комплета за бројање ћелија 8 (Дојиндо).Као контрола, ХеЛа ћелије су третиране са 5 μг/мл актиномицином Д (Акт Д), који инхибира транскрипцију РНК полимеразе и изазива смрт ћелије.Анализе су обављене у три примерка.(е) Тест пролиферације ћелија Е. цоли.Раст Е. цоли је анализиран мерењем ОД600.Као контрола, ћелије су третиране са 50 μг/мл ампицилина (Амп), који инхибира синтезу бактеријског ћелијског зида.Анализе су обављене у три примерка.
Да бисмо дешифровали механизам деловања цитотоксичности изазване једињењима сродним урамидима, поново смо анализирали деривате урбенске киселине са умереним инхибиторним ефектима.као што је приказано на слици.Као што је приказано на сликама 2б, 6а, саднице узгајане на агар плочама које садрже високе концентрације (200 μМ) урмотонске киселине 6 дале су краће и лево закривљене корене (θ = – 23,7 ± 6,1), док су саднице узгајане на контролној подлози, саднице су дале скоро праве корене (θ = – 3,8 ± 7,1).Познато је да је овај карактеристичан коси раст резултат дисфункције кортикалних микротубула14,18.У складу са овим налазом, лекови који дестабилизују микротубуле дизопирамид и оризалин изазвали су слично нагињање корена у нашим условима раста (слике 2б, 6а).Истовремено смо тестирали деривате урмотонске киселине и одабрали неколико њих који у одређеним концентрацијама изазивају коси раст корена.Једињења 8, 9 и 15 су променила смер раста корена на 75 μМ, 50 μМ и 40 μМ, респективно, што указује да ова једињења могу ефикасно да дестабилизују микротубуле (сл. 2б, 6а).Такође смо тестирали најмоћнији дериват урсолне киселине, КАНД 11, у нижој концентрацији (15 µМ) и открили да примена КАНД 11 инхибира раст корена и да је правац раста корена неуједначен, иако имају тенденцију нагињања улево ( Слика Ц3)..Пошто веће концентрације лекова који дестабилизују микротубуле понекад инхибирају раст биљака, а не узрокују нагињање корена, накнадно смо проценили могућност да КАНД 11 утиче на микротубуле посматрајући кортикалне микротубуле у ћелијама епидерме корена.Имунохистохемија применом анти-β-тубулинских антитела у епидермалним ћелијама корена садница третираних са 25 μМ КАНД 11 показала је нестанак скоро свих кортикалних микротубула у епидермалним ћелијама у зони елонгације (слика 6б).Ови резултати показују да кумамотонска киселина и њени деривати делују директно или индиректно на микротубуле да их поремете и да су ова једињења нови инхибитори микротубула.
Урсонска киселина и њени деривати мењају кортикалне микротубуле у Арабидопсис тхалиана.(а) Угао нагиба корена мерен у присуству различитих деривата урмотонске киселине у назначеним концентрацијама.Такође су анализирани ефекти два једињења за која је познато да инхибирају микротубуле: дизопирамида и оризалина.Уметак показује стандард који се користи за мерење угла раста корена.Звездице указују на значајне разлике са лажним третманом (т тест, стр< 0,05).н>19. Скала бар = 1 цм.(б) Кортикалне микротубуле у епидермалним ћелијама у зони елонгације.Микротубуле у коренима дивљег типа Арабидопсис Цол узгајане на МС плочама са или без 25 μМ КАНД 11 су визуелизоване имунохистохемијским бојењем коришћењем примарних антитела на β-тубулин и секундарних антитела коњугованих са Алека Флуор.Скала бар = 10 µм.(ц) Митотичка структура микротубула у меристему корена.Микротубуле су визуелизоване коришћењем имунохистохемијског бојења.Митотичке структуре, укључујући профазне зоне, вретена и фрагмопласте, пребројане су из конфокалних слика.Стрелице показују митотичке структуре микротубула.Звездице указују на значајне разлике са лажним третманом (т тест, стр< 0,05).н>9. Скала бар = 50 µм.
Иако Урса има способност да поремети функцију микротубула, очекује се да ће се њен механизам деловања разликовати од типичних средстава за деполимеризацију микротубула.На пример, веће концентрације агенаса за деполимеризацију микротубула као што су дизопирамид и оризалин индукују анизотропну експанзију епидермалних ћелија, док КАНД 11 не.Поред тога, заједничка примена КАНД 11 и дизопирамида је резултирала комбинованим одговором на раст корена изазван дисопирамидом и примећена је инхибиција раста изазвана КАНД 11 (слика С4).Такође смо анализирали одговор мутанта преосетљивог дизопирамида 1-1 (пхс1-1) на КАНД 11. пхс1-1 има неканонску тачку мутације тубулин киназе и производи краће корене када се лечи дизопирамидом9,20.пхс1-1 мутантне саднице узгајане на агар медијуму који садржи КАНД 11 имале су краће корене сличне онима узгајаним на дизопирамиди (слика С5).
Поред тога, приметили смо митотичке структуре микротубула, као што су профазне зоне, вретена и фрагмопласти, у меристему корена садница третираних са КАНД 11. У складу са запажањима за ЦДКБ2;1п::ЦДКБ2;1-ГУС, значајно смањење уочен је број митотичких микротубула (слика .6ц).
Да бисмо карактерисали цитотоксичност КАНД 11 при субћелијској резолуцији, третирали смо ћелије суспензије дувана БИ-2 са КАНД 11 и посматрали њихов одговор.Прво смо додали КАНД 11 ћелијама БИ-2 које експримирају ТагРФП-ТУА6, који флуоресцентно обележава микротубуле, да бисмо проценили ефекат КАНД 11 на кортикалне микротубуле.Густина кортикалних микротубула је процењена анализом слике, која је квантификовала проценат цитоскелетних пиксела међу цитоплазматским пикселима.Резултати испитивања су показали да је након третмана са 50 μМ или 100 μМ КАНД 11 у трајању од 1 сата, густина значајно смањена на 0,94 ± 0,74% односно 0,23 ± 0,28%, док је густина ћелија третираних ДМСО 631 ± 1. % (слика 7а).Ови резултати су у складу са запажањем код Арабидопсис да третман КАНД 11 индукује деполимеризацију кортикалних микротубула (слика 6б).Такође смо испитали БИ-2 линију са актинским филаментима обележеним ГФП-АБД након третмана са истом концентрацијом КАНД 11 и приметили да третман КАНД 11 поремети актинске филаменте.Третман са 50 μМ или 100 μМ КАНД 11 током 1 х значајно је смањио густину актинских филамената на 1,20 ± 0,62% или 0,61 ± 0,26%, респективно, док је густина у ћелијама третираним ДМСО износила 1,69 ± 0% (Сл.7б).Ови резултати су у супротности са ефектима пропизамида, који не утиче на актинске филаменте, и латрунцулина Б, деполимеризатора актина који не утиче на микротубуле (СИ слика С6).Поред тога, третман са кумамонамидом 1, кумамонамидном киселином 6 или КАНД 11 није утицао на микротубуле у ХеЛа ћелијама (СИ слика С7).Стога се верује да је механизам деловања КАНД 11 другачији од оног код познатих дисруптора цитоскелета.Поред тога, наше микроскопско посматрање БИ-2 ћелија третираних КАНД 11 открило је почетак ћелијске смрти током третмана КАНД 11 и показало да се удео мртвих ћелија обојених Еванс плавом бојом није значајно повећао након 30 минута третмана КАНД 11, док након 90 минута третмана са 50 μМ или 100 μМ КАНД, број мртвих ћелија се повећао на 43,7% односно 80,1% (слика 7ц).Узети заједно, ови подаци указују на то да је нови дериват урсолне киселине КАНД 11 биљно-специфичан цитоскелетни инхибитор са раније непознатим механизмом деловања.
КАНД утиче на кортикалне микротубуле, актинске филаменте и одрживост БИ-2 ћелија дувана.(а) Визуелизација кортикалних микротубула у БИ-2 ћелијама у присуству ТагРФП-ТУА6.БИ-2 ћелије третиране са КАНД 11 (50 μМ или 100 μМ) или ДМСО су испитане конфокалном микроскопијом.Густина кортикалних микротубула је израчуната на основу микроснимака 25 независних ћелија.Слова указују на значајне разлике (Тукеи ХСД тест, стр< 0,05).Скала бар = 10 µм.(б) Кортикални актински филаменти у БИ-2 ћелијама визуелизовани у присуству ГФП-АБД2.БИ-2 ћелије третиране са КАНД 11 (50 μМ или 100 μМ) или ДМСО су испитане конфокалном микроскопијом.Густина кортикалних актинских филамената је израчуната на основу микрографа 25 независних ћелија.Слова указују на значајне разлике (Тукеи ХСД тест, стр< 0,05).Скала бар = 10 µм.(ц) Посматрање мртвих БИ-2 ћелија Евансовим плавим бојењем.БИ-2 ћелије третиране са КАНД 11 (50 μМ или 100 μМ) или ДМСО испитане су микроскопијом светлог поља.н=3.Скала бар = 100 µм.
Откриће и примена нових природних производа довела је до значајног напретка у различитим аспектима људског живота, укључујући медицину и пољопривреду.Спроведена су историјска истраживања ради добијања корисних једињења из природних ресурса.Посебно је познато да су актиномицети корисни као антипаразитски антибиотици за нематоде због своје способности да производе различите секундарне метаболите као што је авермектин, олово једињење ивермектина и блеомицина и његови деривати, који се користе у медицини као средство против рака21,22.Исто тако, из актиномицета су откривена различита хербицидна једињења, од којих се нека већ користе комерцијално1,23.Стога се анализа метаболита актиномицета за изоловање природних производа са жељеним биолошким активностима сматра ефикасном стратегијом.У овој студији смо открили ново једињење, кумамонамид, из С. верраенсис и успешно га синтетизовали.Урсонска киселина је синтетички интермедијер урбенамида и његових деривата.Може изазвати карактеристично увијање корена, показати умерену до јаку хербицидну активност и директно или индиректно оштетити микротубуле биљака.Међутим, механизам деловања урмотонске киселине може да се разликује од оног код постојећих инхибитора микротубула, пошто КАНД 11 такође омета актинске филаменте и изазива смрт ћелије, што сугерише регулаторни механизам помоћу којег урмотонска киселина и њени деривати утичу на широк спектар цитоскелетних структура..
Даља детаљна карактеризација урбенонске киселине ће помоћи да се боље разуме механизам деловања урбенонске киселине.Конкретно, следећи циљ је да се процени способност урсонске киселине да се веже за редуковане микротубуле како би се утврдило да ли урсонска киселина и њени деривати делују директно на микротубуле и деполимеризују их, или њихово деловање доводи до дестабилизације микротубула.Поред тога, у случају када микротубуле нису директна мета, идентификовање места деловања и молекуларних циљева урсонске киселине на биљним ћелијама помоћи ће даљем разумевању својстава сродних једињења и могућих начина да се побољша хербицидна активност.Наш тест биоактивности је открио јединствену цитотоксичну способност урсонске киселине на раст биљака као што су Арабидопсис тхалиана, дуван и јетрењак, док ни Е. цоли ни ХеЛа ћелије нису биле погођене.Мала или никаква токсичност за животињске ћелије је предност деривата урсонске киселине ако су развијени као хербициди за употребу на отвореним пољопривредним пољима.Заиста, пошто су микротубуле уобичајене структуре код еукариота, њихова селективна инхибиција у биљкама је кључни захтев за хербициде.На пример, пропизамид, агенс за деполимеризацију микротубула који се директно везује за тубулин и инхибира полимеризацију, користи се као хербицид због своје ниске токсичности за животињске ћелије24.За разлику од дизопирамида, сродни бензамиди имају различите циљне специфичности.Поред биљних микротубула, РХ-4032 или бензоксамид такође инхибира микротубуле животињских ћелија или оомицета, а залиламид се користи као фунгицид због своје ниске фитотоксичности25,26,27.Новооткривени медвед и његови деривати показују селективну цитотоксичност против биљака, али је вредно напоменути да даље модификације могу променити њихову циљну специфичност, потенцијално обезбеђујући додатне деривате за контролу патогених гљива или оомицета.
Јединствена својства урбенонске киселине и њених деривата су корисна за њихов развој као хербицида и употребу као истраживачких алата.Значај цитоскелета у контроли облика биљних ћелија је широко признат.Раније студије су показале да су биљке развиле сложене механизме организације кортикалних микротубула контролисањем динамике микротубула да би правилно контролисале морфогенезу.Идентификован је велики број молекула одговорних за регулацију активности микротубула, а сродна истраживања су још увек у току3,4,28.Наше тренутно разумевање динамике микротубула у биљним ћелијама не објашњава у потпуности механизме организације кортикалних микротубула.На пример, иако и дисопирамид и оризалин могу да деполимеризују микротубуле, дизопирамид изазива озбиљно изобличење корена, док оризалин има релативно благ ефекат.Штавише, мутације у тубулину, који стабилизује микротубуле, такође изазивају декстроротацију у корену, док паклитаксел, који такође стабилизује динамику микротубула, не.Стога би проучавање и идентификација молекуларних циљева урсолне киселине требало да пружи нови увид у регулацију биљних кортикалних микротубула.Слично томе, будућа поређења хемикалија које су ефикасне у промовисању поремећеног раста, као што је дизопирамид, и мање ефикасних хемикалија, као што су оризалин или кумамоторна киселина, пружиће назнаке о томе како се дешава изобличен раст.
С друге стране, преуређења цитоскелета везана за одбрану су још једна могућност да се објасни цитотоксичност урсонске киселине.Инфекција патогена или уношење елицитора у биљне ћелије понекад изазивају деструкцију цитоскелета и последично ћелијску смрт29.На пример, пријављено је да криптоксантин добијен из оомицета омета микротубуле и актинске филаменте пре смрти ћелија дувана, слично ономе што се дешава са КАНД третманом30,31.Сличности између одбрамбених одговора и ћелијских одговора изазваних урсонском киселином довеле су нас до хипотезе да они покрећу уобичајене ћелијске процесе, иако је очигледан бржи и јачи ефекат урсонске киселине од криптоксантина.Међутим, студије су показале да поремећај актинских филамената промовише спонтану ћелијску смрт, која није увек праћена прекидом микротубула29.Поред тога, остаје да се види да ли или патоген или елицитор изазивају изобличен раст корена, као што то чине деривати урсонске киселине.Дакле, молекуларно знање које повезује одбрамбене одговоре и цитоскелет је атрактиван проблем који треба решити.Искоришћавањем присуства једињења мале молекуларне тежине повезаних са урсонском киселином, као и низа деривата са различитим потенцијалима, они могу пружити могућности за циљање непознатих ћелијских механизама.
Узето заједно, откриће и примена нових једињења која модулирају динамику микротубула ће обезбедити моћне методе за решавање сложених молекуларних механизама који су у основи одређивања облика биљних ћелија.У том контексту, недавно развијено једињење урмотонска киселина, које утиче на микротубуле и актинске филаменте и индукује ћелијску смрт, може пружити прилику да се дешифрује веза између контроле микротубула и ових других механизама.Дакле, хемијска и биолошка анализа коришћењем урбенонске киселине ће нам помоћи да разумемо молекуларне регулаторне механизме који контролишу биљни цитоскелет.
Инокулирајте С. верраенсис МК493-ЦФ1 у ерленмајерску тиквицу од 500 мЛ која садржи 110 мЛ медијума за семе који се састоји од 2% (в/в) галактозе, 2% (в/в) есенције пасте, 1% (в/в) Бакто композиције .-соитон (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Инц.), 0,5% (в/в) екстракт кукуруза (КОГОСТЦХ Цо., Лтд., Јапан), 0,2% (в/в) (НХ4)2СО4 и 0,2% ЦаЦО3 у дејонизованој води.(пХ 7,4 пре стерилизације).Културе семена су инкубиране на ротационој мешалици (180 рпм) на 27°Ц током 2 дана.Гајење производње ферментацијом у чврстом стању.Култура семена (7 мл) је пребачена у боцу К-1 од 500 мл која садржи 40 г производног медијума који се састоји од 15 г пресованог јечма (МУСО Цо., Лтд., Јапан) и 25 г дејонизоване воде (пХ није подешен пре стерилизације).).Ферментација је вршена на 30°Ц у мраку 14 дана.Ферментациони материјал је екстрахован са 40 мл/боци ЕтОХ и центрифугиран (1500 г, 4°Ц, 10 мин).Супернатант културе (60 мл) је екстрахован мешавином 10% МеОХ/ЕтОАц.Органски слој је упарен под сниженим притиском да би се добио остатак (59,5 мг), који је подвргнут ХПЛЦ са градијентом елуирања (0–10 минута: 90%) на колони реверзне фазе (СХИСЕИДО ЦАПЦЕЛЛ ПАК Ц18 УГ120, 5 μм, ИД 10 мм × дужина 250 мм) Х2О/ЦХ3ЦН, 10–35 минута: 90% Х2О/ЦХ3ЦН до 70% Х2О/ЦХ3ЦН (градијент), 35–45 минута: 90% Х2О/ЕтОХ, 45–155 минута: 90% Х2О /ЕтОХ до 100% ЕтОХ (градијент (градијент), 155–200 мин: 100% ЕтОХ) при брзини протока од 1,5 мл/мин, изолован је кумонамид (1, 36,0 мг) као бели аморфни прах.
Кумамотоамид(1);'Х-НМР (500 МХз, ЦДЦ13) 5 6,93 (т, Ј = 2,5 Хз, ИХ), 6,76 (дд, Ј = 4,3, 1,8 Хз ИХ), 6,05 (т, Ј = 3,8 Хз, ИХ).), 4,08 (с, 3Х);13Ц-НМР (125 МХз, ЦДЦ13) 8 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ЕСИ-ХРМС [М+Х]+: [Ц6Х9Н2О2]+ израчуната вредност: 141,0659, измерена вредност: 141,0663, ИР νмак 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 153.
Семе Колумбије (Цол-0) добијено је од Арабидопсис Центра за биолошке ресурсе (АБРЦ) уз дозволу за истраживачку употребу.Семе Цол-0 пропагирано је и одржавано у нашим лабораторијским условима и коришћено као биљке дивљег типа Арабидопсис.Семе Арабидопсис је површински стерилисано и култивисано у медијуму Мурасхиге и Скоог половине јачине који садржи 2% сахарозе (Фујифилм Вако Пуре Цхемицал), 0,05% (в/в) 2-(4-морфолино)етансулфонске киселине (МЕС) (Фујифилм Вако Пуре Цхемицал ).) и 1,5% агар (Фујифилм Вако Пуре Цхемицал), пХ 5,7, на 23 °Ц и константној светлости.Семе мутанта пхс1-1 обезбедио је Т. Хасхимото (Нара Институт за науку и технологију).
Семе соја СР-1 је обезбедио Т. Хасхимото (Нара Институт за науку и технологију) и коришћено је као биљке дивљег типа дувана.Семе дувана је површински стерилисано и натопљено у стерилну воду три ноћи да би се подстакло клијање, а затим стављено у раствор полу-јаче који садржи 2% сахарозе, 0,05% (в/в) МЕС и 0,8% геланске гуме (Фујифилм Вако Пуре Цхемицал) Мурасхиге.и Скоог медијум) са пХ 5,7 и инкубиран на 23°Ц под константном светлошћу.
Сој Так-1 је обезбедио Т. Кохцхи (Кјото универзитет) и коришћен је као стандардна експериментална јединица за испитивање јетре.Гемма је добијена из стерилисаних култивисаних биљака, а затим постављена на медијум Гамборг Б5 (Фујифилм Вако Пуре Цхемицал) који садржи 1% сахарозе и 0,3% геланске гуме и инкубирана на 23°Ц под непрекидном светлошћу.
Дуванске БИ-2 ћелије (Ницотиана табацум Л. цв. Бригхт Иеллов 2) обезбедио је С. Хасезава (Универзитет у Токију).БИ-2 ћелије су разблажене 95 пута у модификованом Линсмеиер-овом и Скооговом медијуму и допуњене недељно са 2,4-дихлорофеноксисирћетном киселином 32 .Суспензија ћелија је мешана на ротационој мешалици на 130 рпм на 27°Ц у мраку.Исперите ћелије са 10 пута већом запремином свежег медијума и ресуспендујте у истом медијуму.БИ-2 трансгене ћелијске линије које стабилно експримирају маркер микротубула ТагРФП-ТУА6 или маркер актинских филамената ГФП-АБД2 испод промотора 35С вируса мозаика карфиола су генерисане као што је описано33,34,35.Ове ћелијске линије се могу одржавати и синхронизовати коришћењем процедура сличних онима које се користе за оригиналну БИ-2 ћелијску линију.
ХеЛа ћелије су узгајане у Дулбеццо-овом модификованом Еагле-овом медијуму (ДМЕМ) (Лифе Тецхнологиес) са додатком 10% феталног говеђег серума, 1,2 У/мл пеницилина и 1,2 μг/мл стрептомицина у инкубатору на 37°Ц са 5% ЦО2.
Сви експерименти описани у овом рукопису изведени су у складу са јапанским прописима и смерницама о биолошкој безбедности.
Једињења су растворена у диметил сулфоксиду (ДМСО; Фујифилм Вако Пуре Цхемицал) као основни раствори и разблажена у МС медијуму за Арабидопсис и дуван или Гамборг Б5 медијуму за џигерицу.За тест инхибиције раста корена, више од 10 семена по плочи је посејано на агар медијум који садржи наведена једињења или ДМСО.Семе је инкубирано у комори за раст 7 дана.Саднице су фотографисане и измерена је дужина корена.За тест клијања Арабидопсис, 48 семена по плочи је посејано на агар медијум који садржи 200 μМ једињења или ДМСО.Семе Арабидопсис узгајано је у комори за раст и број клијанаца је пребројан 7 дана након ницања (даг).За тест клијања дувана, 24 семена по плочи посејано је на агар медијум који садржи 200 μМ КАНД или ДМСО.Семе дувана је узгајано у комори за раст и број клијавих садница је пребројан након 14 дана.За тест инхибиције раста јетрењаче, 9 ембриона са сваке плоче је постављено на агар медијум који садржи назначене концентрације КАНД или ДМСО и инкубирано у комори за раст током 14 дана.
Користите саднице обојене са 5 мг/мл пропидијум јодида (ПИ) да визуализујете организацију меристема корена.ПИ сигнали су посматрани флуоресцентном микроскопијом коришћењем ТЦС СПЕ конфокалног ласерског скенирајућег микроскопа (Леица Мицросистемс).
Хистохемијско бојење корена β-глукуронидазом (ГУС) изведено је према протоколу који су описали Малами и Бенфеи36.Саднице су фиксиране у 90% ацетону преко ноћи, обојене са 0,5 мг/мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-д-глукуронске киселине у ГУС пуферу 1 сат и стављене у хидратисани раствор хлоралдехида.(8 г хлорал хидрата, 2 мл воде и 1 мл глицерола) и посматрано помоћу диференцијалне интерферентне контрастне микроскопије помоћу микроскопа Акио Имагер М1 (Царл Зеисс).
Углови корена су мерени на 7-дневним садницама које су узгајане на вертикално постављеним плочама.Измерите угао корена из правца вектора гравитације као што је описано у кораку 6.
Распоред кортикалних микротубула је посматран како је описано, са мањим модификацијама протокола 37 .Анти-β-тубулинско антитело (КМКС-1, Мерк Миллипоре: МАБ3408) и Алека Флуор 488-коњуговани анти-мишји ИгГ (Тхермо Фисхер Сциентифиц: А32723) коришћени су као примарна и секундарна антитела у разблажењима 1:1000 и 1:100 редом.Флуоресцентне слике су добијене коришћењем ТЦС СПЕ конфокалног ласерског скенирајућег микроскопа (Леица Мицросистемс).Набавите З-стацк слике и креирајте пројекције максималног интензитета према упутствима произвођача.
Тест пролиферације ХеЛа ћелија је изведен коришћењем Целл Цоунтинг Кит 8 (Дојиндо) према упутствима произвођача.
Раст Е. цоли ДХ5α је анализиран мерењем густине ћелија у култури коришћењем спектрофотометра на 600 нм (ОД600).
Организација цитоскелета у трансгеним БИ-2 ћелијама посматрана је коришћењем флуоресцентног микроскопа опремљеног ЦСУ-Кс1 конфокалним уређајем за скенирање (Иокогава) и сЦМОС камером (Зила, Андор Тецхнологи).Густина цитоскелета је процењена анализом слике, која је квантификовала проценат цитоскелетних пиксела међу цитоплазматским пикселима на конфокалним сликама коришћењем софтвера ИмагеЈ као што је описано38,39.
Да би се открила ћелијска смрт у БИ-2 ћелијама, аликвот ћелијске суспензије је инкубиран са 0,05% Еванс блуе током 10 минута на собној температури.Селективно Евансово плаво бојење мртвих ћелија зависи од екструзије боје из живих ћелија интактном плазма мембраном40.Обојене ћелије су посматране коришћењем микроскопа са светлим пољем (БКС53, Олимпус).
ХеЛа ћелије су узгајане у ДМЕМ са додатком 10% ФБС у влажном инкубатору на 37 ° Ц и 5% ЦО2.Ћелије су третиране са 100 μМ КАНД 11, кумамонаминском киселином 6, кумамонамидом 1, 100 нг / мл колцемида (Гибцо) или 100 нг / мл Ноцодмазе (Сигма) током 6 х на 37 ° Ц.Ћелије су фиксиране са МетОХ током 10 мин, а затим са ацетатом током 5 мин на собној температури.Фиксне ћелије су инкубиране са примарним антителом на β-тубулин (1Д4А4, Протеинтецх: 66240-1) разблаженим у 0,5% БСА/ПБС током 2 сата, испране 3 пута са ТБСТ, а затим инкубиране са Алека Флуор козјим антителом.488 1 сат.– ИгГ миша (Тхермо Фисхер Сциентифиц: А11001) и 15 нг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (ДАПИ) разблажених у 0,5% БСА/ПБС.Након три пута испирања са ТБСТ, обојене ћелије су примећене на Никон Ецлипсе Ти-Е инвертованом микроскопу.Слике су снимљене хлађеном Хамаматсу ОРЦА-Р2 ЦЦД камером коришћењем софтвера МетаМорпх (Молецулар Девицес).
Време поста: 17.06.2024