Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену CSS подршку. За најбоље резултате, препоручујемо вам да користите новију верзију прегледача (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказујемо сајт без стилизовања или JavaScript-а.
Комбинације инсектицидних једињења биљног порекла могу показати синергијске или антагонистичке интеракције против штеточина. С обзиром на брзо ширење болести које преносе комарци Aedes и све већу отпорност популација комараца Aedes на традиционалне инсектициде, двадесет осам комбинација терпенских једињења заснованих на биљним есенцијалним уљима је формулисано и тестирано против ларвалних и одраслих стадијума Aedes aegypti. Пет биљних есенцијалних уља (ЕО) је првобитно процењено на њихову ларвицидну и ефикасност код одраслих јединки, а два главна једињења су идентификована у сваком ЕО на основу резултата GC-MS. Купљена су главна идентификована једињења, наиме диалил дисулфид, диалил трисулфид, карвон, лимонен, еугенол, метил еугенол, еукалиптол, еудесмол и алфа-пинен против комараца. Бинарне комбинације ових једињења су затим припремљене коришћењем сублеталних доза и њихови синергијски и антагонистички ефекти су тестирани и одређени. Најбоље ларвицидне композиције се добијају мешањем лимонена са диалил дисулфидом, а најбоље адултицидне композиције се добијају мешањем карвона са лимоненом. Комерцијално коришћени синтетички ларвицид Темфос и лек за одрасле Малатион тестирани су одвојено и у бинарним комбинацијама са терпеноидима. Резултати су показали да је комбинација темефоса и диалил дисулфида и малатиона и еудесмола била најефикаснија комбинација. Ове снажне комбинације имају потенцијал за употребу против Aedes aegypti.
Етерична уља биљака (ЕО) су секундарни метаболити који садрже различита биоактивна једињења и постају све важнија као алтернатива синтетичким пестицидима. Не само да су еколошки прихватљива и једноставна за коришћење, већ су и мешавина различитих биоактивних једињења, што такође смањује вероватноћу развоја резистенције на лекове1. Користећи ГЦ-МС технологију, истраживачи су испитали састојке различитих етеричних уља биљака и идентификовали више од 3.000 једињења из 17.500 ароматичних биљака2, од којих је већина тестирана на инсектицидна својства и за које се наводи да имају инсектицидне ефекте3,4. Неке студије истичу да је токсичност главне компоненте једињења иста или већа од токсичности његовог сировог етилен оксида. Али употреба појединачних једињења може поново оставити простора за развој резистенције, као што је случај са хемијским инсектицидима5,6. Стога је тренутни фокус на припреми смеша једињења на бази етилен оксида како би се побољшала инсектицидна ефикасност и смањила вероватноћа резистенције код циљних популација штеточина. Појединачна активна једињења присутна у ЕО могу показати синергистичке или антагонистичке ефекте у комбинацијама које одражавају укупну активност ЕО, чињеница која је добро наглашена у студијама које су спровели претходни истраживачи7,8. Програм сузбијања вектора такође укључује ЕО и његове компоненте. Комарицидно дејство есенцијалних уља је опширно проучавано на комарцима Culex и Anopheles. Неколико студија је покушало да развију ефикасне пестициде комбиновањем различитих биљака са комерцијално коришћеним синтетичким пестицидима како би се повећала укупна токсичност и минимизирали нежељени ефекти9. Али студије таквих једињења против Aedes aegypti остају ретке. Напредак у медицинској науци и развој лекова и вакцина помогли су у борби против неких болести које преносе вектори. Али присуство различитих серотипова вируса, које преноси комарац Aedes aegypti, довело је до неуспеха програма вакцинације. Стога, када се такве болести појаве, програми сузбијања вектора су једина опција за спречавање ширења болести. У тренутној ситуацији, контрола Aedes aegypti је веома важна јер је кључни вектор разних вируса и њихових серотипова који изазивају денга грозницу, Зику, хеморагичну денга грозницу, жуту грозницу итд. Најзначајнија ствар је чињеница да се број случајева скоро свих векторских болести које преноси Aedes повећава сваке године у Египту и повећава се широм света. Стога, у овом контексту, постоји хитна потреба за развојем еколошки прихватљивих и ефикасних мера контроле популација Aedes aegypti. Потенцијални кандидати у том погледу су етерични олово (ЕО), њихова саставна једињења и њихове комбинације. Стога је ова студија покушала да идентификује ефикасне синергијске комбинације кључних биљних ЕО једињења из пет биљака са инсектицидним својствима (тј. нана, свети босиљак, пегави еукалиптус, сумпорни лук и мелалеука) против Aedes aegypti.
Сви одабрани етерични сорбати (ЕО) показали су потенцијалну ларвицидну активност против Aedes aegypti са 24-часовном ЛЦ50 вредношћу у распону од 0,42 до 163,65 ppm. Највећа ларвицидна активност забележена је код ЕО пеперминта (Mp) са вредношћу ЛЦ50 од 0,42 ppm на 24 сата, а затим код белог лука (As) са вредношћу ЛЦ50 од 16,19 ppm на 24 сата (Табела 1).
Са изузетком Ocimum Sainttum, Os EO, сва четири остала тестирана EO показала су очигледне алерцидне ефекте, са вредностима LC50 у распону од 23,37 до 120,16 ppm током периода излагања од 24 сата. Thymophilus striata (Cl) EO је био најефикаснији у убијању одраслих јединки са LC50 вредношћу од 23,37 ppm у року од 24 сата од излагања, а затим Eucalyptus maculata (Em) који је имао LC50 вредност од 101,91 ppm (Табела 1). С друге стране, LC50 вредност за Os још није утврђена, јер је највећа стопа смртности од 53% забележена при највећој дози (Додатна слика 3).
Два главна састојна једињења у сваком EO су идентификована и одабрана на основу резултата базе података NIST библиотеке, процента површине GC хроматограма и резултата MS спектара (Табела 2). За EO As, главна идентификована једињења била су диалил дисулфид и диалил трисулфид; за EO Mp, главна идентификована једињења била су карвон и лимонен, за EO Em, главна идентификована једињења била су еудесмол и еукалиптол; за EO Os, главна идентификована једињења била су еугенол и метил еугенол, а за EO Cl, главна идентификована једињења била су еугенол и α-пинен (Слика 1, Допунске слике 5–8, Допунска табела 1–5).
Резултати масене спектрометрије главних терпеноида одабраних етеричних уља (А-диалил дисулфид; Б-диалил трисулфид; Ц-еугенол; Д-метил еугенол; Е-лимонен; Ф-ароматични цеперон; Г-α-пинен; Х-цинеол; Р-еудамол).
Укупно девет једињења (диалил дисулфид, диалил трисулфид, еугенол, метил еугенол, карвон, лимонен, еукалиптол, еудесмол, α-пинен) идентификована су као ефикасна једињења која су главне компоненте ЕО и појединачно су биолошки тестирана против Aedes aegypti у ларвалним фазама. Једињење еудесмол имало је највећу ларвицидну активност са LC50 вредношћу од 2,25 ppm након 24 сата излагања. Утврђено је да једињења диалил дисулфид и диалил трисулфид такође имају потенцијалне ларвицидне ефекте, са средњим сублеталним дозама у распону од 10–20 ppm. Умерена ларвицидна активност је поново примећена за једињења еугенол, лимонен и еукалиптол са LC50 вредностима од 63,35 ppm, 139,29 ppm и 181,33 ppm након 24 сата, респективно (Табела 3). Међутим, није пронађен значајан ларвицидни потенцијал метил еугенола и карвона чак ни при највишим дозама, тако да вредности LC50 нису израчунате (Табела 3). Синтетички ларвицид Темефос имао је просечну смртоносну концентрацију од 0,43 ppm против Aedes aegypti током 24 сата излагања (Табела 3, Додатна табела 6).
Седам једињења (диалил дисулфид, диалил трисулфид, еукалиптол, α-пинен, еудесмол, лимонен и карвон) идентификована су као главна једињења ефикасног ЕО и тестирана су појединачно против одраслих египатских комараца врсте Aedes. Према Probit регресионој анализи, утврђено је да еудесмол има највећи потенцијал са LC50 вредношћу од 1,82 ppm, а затим следи еукалиптол са LC50 вредношћу од 17,60 ppm при времену излагања од 24 сата. Преосталих пет тестираних једињења била су умерено штетна за одрасле са LC50 вредностима у распону од 140,79 до 737,01 ppm (Табела 3). Синтетички органофосфорни малатион био је мање потентан од еудесмола и јачи од осталих шест једињења, са LC50 вредношћу од 5,44 ppm током периода излагања од 24 сата (Табела 3, Додатна табела 6).
Седам потентних водећих једињења и органофосфорни тамефосат одабрани су за формулисање бинарних комбинација њихових LC50 доза у односу 1:1. Укупно 28 бинарних комбинација је припремљено и тестирано на њихову ларвицидну ефикасност против Aedes aegypti. Утврђено је да је девет комбинација синергистичко, 14 комбинација антагонистичко, а пет комбинација није ларвицидно. Међу синергистичким комбинацијама, комбинација диалил дисулфида и темофола била је најефикаснија, са 100% морталитетом примећеним након 24 сата (Табела 4). Слично томе, смеше лимонена са диалил дисулфидом и еугенола са тиметфосом показале су добар потенцијал са примећеним морталитетом ларви од 98,3% (Табела 5). Преостале 4 комбинације, наиме еудесмол плус еукалиптол, еудесмол плус лимонен, еукалиптол плус алфа-пинен, алфа-пинен плус темефос, такође су показале значајну ларвицидну ефикасност, са примећеним стопама морталитета већим од 90%. Очекивана стопа морталитета је близу 60-75%. (Табела 4). Међутим, комбинација лимонена са α-пиненом или еукалиптусом показала је антагонистичке реакције. Слично томе, утврђено је да смеше Темефоса са еугенолом или еукалиптусом или еудесмолом или диалил трисулфидом имају антагонистичке ефекте. Слично томе, комбинација диалил дисулфида и диалил трисулфида и комбинација било ког од ових једињења са еудесмолом или еугенолом имају антагонистичко дејство на ларвицид. Антагонизам је такође пријављен код комбинације еудесмола са еугенолом или α-пиненом.
Од свих 28 бинарних смеша тестираних на киселу активност код одраслих јединки, 7 комбинација је било синергистичко, 6 није имало ефекта, а 15 је било антагонистичко. Утврђено је да су смеше еудесмола са еукалиптусом и лимонена са карвоном ефикасније од других синергистичких комбинација, са стопама морталитета након 24 сата од 76% и 100%, респективно (Табела 5). Примећено је да малатион показује синергистички ефекат са свим комбинацијама једињења осим лимонена и диалил трисулфида. С друге стране, антагонизам је пронађен између диалил дисулфида и диалил трисулфида и комбинације било ког од њих са еукалиптусом, или еукалиптолом, или карвоном, или лимоненом. Слично томе, комбинације α-пинена са еудесмолом или лимоненом, еукалиптола са карвоном или лимоненом и лимонена са еудесмолом или малатионом показале су антагонистичке ларвицидне ефекте. За преосталих шест комбинација није било значајне разлике између очекиване и примећене смртности (Табела 5).
На основу синергистичких ефеката и сублеталних доза, њихова ларвицидна токсичност против великог броја комараца *Aedes aegypti* је коначно одабрана и даље тестирана. Резултати су показали да је примећена смртност ларви коришћењем бинарних комбинација еугенол-лимонен, диалил дисулфид-лимонен и диалил дисулфид-тимефос била 100%, док је очекивана смртност ларви била 76,48%, 72,16% и 63,4%, респективно (Табела 6). Комбинација лимонена и еудесмола била је релативно мање ефикасна, са 88% примећене смртности ларви током периода излагања од 24 сата (Табела 6). Укратко, четири одабране бинарне комбинације су такође показале синергистичке ларвицидне ефекте против *Aedes aegypti* када су примењене у великим размерама (Табела 6).
За адултоцидни биолошки тест за контролу великих популација одраслих јединки *Aedes aegypti* одабране су три синергистичке комбинације. Да бисмо одабрали комбинације за тестирање на великим колонијама инсеката, прво смо се фокусирали на две најбоље синергистичке комбинације терпена, наиме карвон плус лимонен и еукалиптол плус еудесмол. Друго, најбоља синергистичка комбинација је одабрана из комбинације синтетичког органофосфата малатиона и терпеноида. Верујемо да је комбинација малатиона и еудесмола најбоља комбинација за тестирање на великим колонијама инсеката због највећег примећеног морталитета и веома ниских LC50 вредности кандидата за састојке. Малатион показује синергизам у комбинацији са α-пиненом, диалил дисулфидом, еукалиптусом, карвоном и еудесмолом. Али ако погледамо LC50 вредности, еудесмол има најнижу вредност (2,25 ppm). Израчунате вредности LC50 малатиона, α-пинена, диалил дисулфида, еукалиптола и карвона биле су 5,4, 716,55, 166,02, 17,6 и 140,79 ppm, респективно. Ове вредности указују да је комбинација малатиона и еудесмола оптимална комбинација у погледу дозирања. Резултати су показали да су комбинације карвона плус лимонена и еудесмола плус малатиона имале 100% примећену смртност у поређењу са очекиваном стопом смртности од 61% до 65%. Друга комбинација, еудесмол плус еукалиптол, показала је стопу смртности од 78,66% након 24 сата излагања, у поређењу са очекиваном стопом смртности од 60%. Све три одабране комбинације показале су синергистичке ефекте чак и када су примењене у великој мери против одраслих јединки врсте *Aedes aegypti* (Табела 6).
У овој студији, одабрани биљни етерични оксиди као што су Mp, As, Os, Em и Cl показали су обећавајуће смртоносне ефекте на ларвалне и одрасле стадијуме Aedes aegypti. Mp EO је имао највећу ларвицидну активност са LC50 вредношћу од 0,42 ppm, а затим су следили As, Os и Em EO са LC50 вредношћу мањом од 50 ppm након 24 сата. Ови резултати су у складу са претходним студијама комараца и других диптерних мува10,11,12,13,14. Иако је ларвицидни потенцијал Cl нижи од других етеричних уља, са LC50 вредношћу од 163,65 ppm након 24 сата, његов потенцијал за одрасле је највећи са LC50 вредношћу од 23,37 ppm након 24 сата. Mp, As и Em EO су такође показали добар алервицидни потенцијал са LC50 вредностима у распону од 100–120 ppm након 24 сата излагања, али су биле релативно ниже од њихове ларвицидне ефикасности. С друге стране, EO Os је показао занемарљив алерцидни ефекат чак и при највишој терапијској дози. Дакле, резултати указују да токсичност етилен оксида за биљке може варирати у зависности од развојне фазе комараца15. Такође зависи од брзине продирања EO у тело инсекта, њихове интеракције са специфичним циљним ензимима и капацитета детоксикације комарца у свакој развојној фази16. Велики број студија је показао да је главно компонентно једињење важан фактор у биолошкој активности етилен оксида, јер чини већину укупних једињења3,12,17,18. Стога смо разматрали два главна једињења у сваком EO. На основу резултата GC-MS, диалил дисулфид и диалил трисулфид су идентификовани као главна једињења EO As, што је у складу са претходним извештајима19,20,21. Иако су претходни извештаји указивали да је ментол једно од његових главних једињења, карвон и лимонен су поново идентификовани као главна једињења Mp EO22,23. Профил састава Os EO показао је да су еугенол и метил еугенол главна једињења, што је слично налазима ранијих истраживача16,24. Еукалиптол и еукалиптол су пријављени као главна једињења присутна у уљу листа Ем, што је у складу са налазима неких истраживача25,26 али супротно налазима Олаладеа и др.27. Доминација цинеола и α-пинена је примећена у етеричном уљу мелалеуке, што је слично претходним студијама28,29. Интраспецифичне разлике у саставу и концентрацији етеричних уља екстрахованих из истих биљних врста на различитим локацијама су пријављене и примећене су и у овој студији, на које утичу географски услови раста биљака, време жетве, фаза развоја или старост биљке, појава хемотипова итд.22,30,31,32. Кључна идентификована једињења су затим купљена и тестирана на њихове ларвицидне ефекте и ефекте на одрасле комарце Aedes aegypti. Резултати су показали да је ларвицидна активност диалил дисулфида упоредива са активношћу сировог EO As. Међутим, активност диалил трисулфида је већа од EO As. Ови резултати су слични онима које су добили Кимбарис и др. 33 на Culex philippines. Међутим, ова два једињења нису показала добру аутоцидну активност против циљних комараца, што је у складу са резултатима Плата-Руеде и др. 34 на Tenebrio molitor. Os EO је ефикасан против ларвалне фазе Aedes aegypti, али не и против одрасле фазе. Утврђено је да је ларвицидна активност главних појединачних једињења нижа од активности сировог Os EO. Ово имплицира улогу других једињења и њихових интеракција у сировом етилен оксиду. Метил еугенол сам по себи има занемарљиву активност, док еугенол сам по себи има умерену ларвицидну активност. Овај закључак потврђује, с једне стране, 35, 36, а са друге стране, противречи закључцима ранијих истраживача 37, 38. Разлике у функционалним групама еугенола и метилеугенола могу довести до различите токсичности за истог циљног инсекта39. Утврђено је да лимонен има умерену ларвицидну активност, док је ефекат карвона био безначајан. Слично томе, релативно ниска токсичност лимонена за одрасле инсекте и висока токсичност карвона подржавају резултате неких претходних студија40, али противрече другима41. Присуство двоструких веза и на интрацикличним и на егзоцикличним позицијама може повећати користи ових једињења као ларвицида3,41, док карвон, који је кетон са незасићеним алфа и бета угљеницима, може показати већи потенцијал за токсичност код одраслих42. Међутим, појединачне карактеристике лимонена и карвона су много ниже од укупног EO Mp (Табела 1, Табела 3). Међу тестираним терпеноидима, утврђено је да еудесмол има највећу ларвицидну и адултну активност са LC50 вредношћу испод 2,5 ppm, што га чини обећавајућим једињењем за контролу комараца Aedes. Његове перформансе су боље од перформанси целог EO Em, иако то није у складу са налазима Ченга и др.40. Еудесмол је сесквитерпене са две изопренске јединице који је мање испарљив од оксигенисаних монотерпена попут еукалиптуса и стога има већи потенцијал као пестицид. Сам еукалиптол има већу активност на одрасле него на ларвицидну активност, а резултати ранијих студија то и потврђују и оповргавају37,43,44. Сама активност је скоро упоредива са активношћу целог EO Cl. Други бициклични монотерпен, α-пинен, има мањи ефекат на одрасле јединке на Aedes aegypti него ларвицидни ефекат, што је супротно од ефекта пуног EO Cl. На укупну инсектицидну активност терпеноида утичу њихова липофилност, испарљивост, гранање угљеника, површина пројекције, површина, функционалне групе и њихови положаји45,46. Ова једињења могу деловати уништавањем ћелијских акумулација, блокирањем респираторне активности, прекидањем преноса нервних импулса итд. 47 Утврђено је да синтетички органофосфат Темефос има највећу ларвицидну активност са LC50 вредношћу од 0,43 ppm, што је у складу са Лековим подацима -Утала 48. Активност синтетичког органофосфорног малатиона код одраслих је пријављена на 5,44 ppm. Иако су ова два органофосфата показала повољне реакције против лабораторијских сојева Aedes aegypti, отпорност комараца на ова једињења је пријављена у различитим деловима света 49. Међутим, нису пронађени слични извештаји о развоју отпорности на биљне лекове 50. Стога се ботанички производи сматрају потенцијалним алтернативама хемијским пестицидима у програмима сузбијања вектора.
Ларвицидни ефекат је тестиран на 28 бинарних комбинација (1:1) припремљених од потентних терпеноида и терпеноида са тиметфосом, и утврђено је да је 9 комбинација синергистичко, 14 антагонистичко и 5 антагонистичко. Без ефекта. С друге стране, у биолошком тесту потенције код одраслих, утврђено је да је 7 комбинација синергистичко, 15 комбинација антагонистичко, а за 6 комбинација је пријављено да немају ефекат. Разлог зашто одређене комбинације производе синергистички ефекат може бити због тога што кандидатска једињења истовремено интерагују у различитим важним путевима или због секвенцијалне инхибиције различитих кључних ензима одређеног биолошког пута51. Утврђено је да је комбинација лимонена са диалил дисулфидом, еукалиптусом или еугенолом синергистичка и у малим и у великим применама (Табела 6), док је утврђено да његова комбинација са еукалиптусом или α-пиненом има антагонистичке ефекте на ларве. У просеку, лимонен изгледа добар синергиста, вероватно због присуства метил група, доброг продирања у стратум корнеум и другачијег механизма деловања52,53. Раније је објављено да лимонен може изазвати токсичне ефекте продирањем у кутикуле инсеката (контактна токсичност), утицајем на дигестивни систем (антифидент) или утицајем на респираторни систем (фумигациона активност), 54 док фенилпропаноиди попут еугенола могу утицати на метаболичке ензиме 55. Стога, комбинације једињења са различитим механизмима деловања могу повећати укупни смртоносни ефекат смеше. Утврђено је да је еукалиптол синергистички са диалил дисулфидом, еукалиптусом или α-пиненом, али друге комбинације са другим једињењима нису биле или ларвицидне или антагонистичке. Ране студије су показале да еукалиптол има инхибиторну активност на ацетилхолинестеразу (AChE), као и на октааминске и GABA рецепторе56. Пошто циклични монотерпени, еукалиптол, еугенол итд. могу имати исти механизам деловања као и њихова неуротоксична активност, 57 чиме се минимизирају њихови комбиновани ефекти кроз међусобну инхибицију. Исто тако, утврђено је да је комбинација Темефоса са диалил дисулфидом, α-пиненом и лимоненом синергистичка, што подржава претходне извештаје о синергијском ефекту између биљних производа и синтетичких органофосфата58.
Утврђено је да комбинација еудесмола и еукалиптола има синергистички ефекат на ларвалне и одрасле стадијуме Aedes aegypti, вероватно због њихових различитих начина деловања услед различитих хемијских структура. Еудесмол (сесквитерпенен) може утицати на респираторни систем 59, а еукалиптол (монотерпен) може утицати на ацетилхолинестеразу 60. Истовремено излагање састојака двама или више циљних места може појачати укупни смртоносни ефекат комбинације. У биолошким тестовима на одрасле супстанце, утврђено је да је малатион синергистички делује са карвоном или еукалиптолом или еукалиптолом или диалил дисулфидом или α-пиненом, што указује да је синергистички делује са додатком лимонена и ди-дисулфида. Добри синергистички кандидати за алергене за цео портфолио терпенских једињења, са изузетком алил трисулфида. Тангам и Катиресан 61 су такође известили о сличним резултатима синергијског ефекта малатиона са биљним екстрактима. Овај синергистички одговор може бити последица комбинованих токсичних ефеката малатиона и фитохемикалија на ензиме за детоксикацију инсеката. Органофосфати попут малатиона генерално делују инхибирањем цитохром П450 естераза и монооксигеназа62,63,64. Стога, комбиновање малатиона са овим механизмима деловања и терпена са различитим механизмима деловања може појачати укупни смртоносни ефекат на комарце.
С друге стране, антагонизам указује на то да су одабрана једињења мање активна у комбинацији него свако једињење појединачно. Разлог за антагонизам у неким комбинацијама може бити тај што једно једињење модификује понашање другог једињења променом брзине апсорпције, дистрибуције, метаболизма или излучивања. Рани истраживачи су сматрали да је ово узрок антагонизма у комбинацијама лекова. Молекули Могући механизам 65. Слично томе, могући узроци антагонизма могу бити повезани са сличним механизмима деловања, конкуренцијом саставних једињења за исти рецептор или циљно место. У неким случајевима, може доћи и до некомпетитивне инхибиције циљног протеина. У овој студији, два органосумпорна једињења, диалил дисулфид и диалил трисулфид, показала су антагонистичке ефекте, вероватно због конкуренције за исто циљно место. Слично томе, ова два сумпорна једињења показала су антагонистичке ефекте и нису имала ефекат када су комбинована са еудесмолом и α-пиненом. Еудесмол и алфа-пинен су цикличне природе, док су диалил дисулфид и диалил трисулфид алифатичне природе. На основу хемијске структуре, комбинација ових једињења требало би да повећа укупну смртоносну активност, јер су им циљна места обично различита34,47, али смо експериментално пронашли антагонизам, који може бити последица улоге ових једињења у неким непознатим организмима in vivo системима као резултат интеракције. Слично томе, комбинација цинеола и α-пинена изазвала је антагонистичке одговоре, иако су истраживачи раније известили да ова два једињења имају различите циљеве деловања47,60. Пошто су оба једињења циклични монотерпени, могу постојати нека заједничка циљна места која могу да се такмиче за везивање и утичу на укупну токсичност проучаваних комбинаторних парова.
На основу вредности LC50 и примећеног морталитета, одабране су две најбоље синергијске комбинације терпена, наиме парови карвон + лимонен и еукалиптол + еудесмол, као и синтетички органофосфорни малатион са терпенима. Оптимална синергистичка комбинација једињења малатион + еудесмол тестирана је у биолошком тесту на одрасле инсекте. Циљати велике колоније инсеката како би се потврдило да ли ове ефикасне комбинације могу деловати против великог броја јединки на релативно великим просторима изложености. Све ове комбинације показују синергистички ефекат против великих ројева инсеката. Слични резултати су добијени за оптималну синергистичку ларвицидну комбинацију тестирану против великих популација ларви Aedes aegypti. Стога се може рећи да је ефикасна синергистичка ларвицидна и адулцидна комбинација биљних ЕО једињења јак кандидат против постојећих синтетичких хемикалија и да се може даље користити за контролу популација Aedes aegypti. Слично томе, ефикасне комбинације синтетичких ларвицида или адулцида са терпенима могу се користити и за смањење доза тиметфоса или малатиона које се примењују на комарце. Ове снажне синергијске комбинације могу пружити решења за будуће студије о еволуцији резистенције на лекове код комараца Aedes.
Јаја природне животиње (Aedes aegypti) су сакупљена из Регионалног центра за медицинска истраживања, Дибругарх, Индијског савета за медицинска истраживања и чувана су на контролисаној температури (28 ± 1 °C) и влажности (85 ± 5%) у Одељењу за зоологију, Универзитета Гаухати, под следећим условима: Ариволи су описани и др. Након излегања, ларве су храњене ларвалном храном (прах за псећи бисквит и квасац у односу 3:1), а одрасле јединке су храњене 10% раствором глукозе. Почевши од 3. дана након излегања, одраслим женкама комараца је дозвољено да сисају крв албино пацова. Потопите филтер папир у воду у чаши и ставите је у кавез за полагање јаја.
Одабрани узорци биљака, наиме листови еукалиптуса (Myrtaceae), свети босиљак (Lamiaceae), нана (Lamiaceae), чајна леука (Myrtaceae) и луковице алијума (Amaryllidaceae). Сакупљени из Гувахатија и идентификовани од стране Одељења за ботанику, Универзитета Гаухати. Сакупљени узорци биљака (500 г) подвргнути су хидродестилацији коришћењем Клевенџер апарата током 6 сати. Екстраховани ЕО је сакупљен у чисте стаклене бочице и чуван на 4°C за даља проучавања.
Ларвицидна токсичност је проучавана коришћењем благо модификованих стандардних процедура Светске здравствене организације 67. Користити ДМСО као емулгатор. Свака концентрација ЕО је првобитно тестирана на 100 и 1000 ppm, излажући 20 ларви у свакој репликацији. На основу резултата, примењен је опсег концентрација и морталитет је забележен од 1 сата до 6 сати (у интервалима од 1 сата), и након 24 сата, 48 сати и 72 сата након третмана. Сублеталне концентрације (ЛЦ50) су одређене након 24, 48 и 72 сата излагања. Свака концентрација је тестирана у три примерка заједно са једном негативном контролом (само вода) и једном позитивном контролом (вода третирана ДМСО). Ако дође до пупације и више од 10% ларви контролне групе угине, експеримент се понавља. Ако је стопа морталитета у контролној групи између 5-10%, користити Аботову формулу за корекцију 68.
Метод који су описали Рамар и др.69 коришћен је за биолошки тест на одрасле комарце Aedes aegypti користећи ацетон као растварач. Сваки ЕО је првобитно тестиран на одрасле комарце Aedes aegypti у концентрацијама од 100 и 1000 ppm. Нанесите 2 мл сваког припремљеног раствора на Вотманов број. 1 комад филтер папира (величине 12 x 15 цм2) и оставите да ацетон испари 10 минута. Филтер папир третиран са само 2 мл ацетона коришћен је као контрола. Након што је ацетон испарио, третирани филтер папир и контролни филтер папир су стављени у цилиндричну цев (дубине 10 цм). Десет комараца старих 3 до 4 дана који се не хране крвљу пребачени су у три примерка сваке концентрације. На основу резултата прелиминарних тестова, тестиране су различите концентрације одабраних уља. Морталитет је забележен након 1 сата, 2 сата, 3 сата, 4 сата, 5 сати, 6 сати, 24 сата, 48 сати и 72 сата након пуштања комараца. Израчунајте вредности LC50 за време излагања од 24 сата, 48 сати и 72 сата. Ако стопа морталитета контролне групе прелази 20%, поновите цео тест. Слично томе, ако је стопа морталитета у контролној групи већа од 5%, прилагодите резултате за третиране узорке користећи Аботову формулу68.
За анализу саставних једињења одабраних етеричних уља спроведене су гасна хроматографија (Agilent 7890A) и масена спектрометрија (Accu TOF GCv, Jeol). GC је био опремљен FID детектором и капиларном колоном (HP5-MS). Носећи гас је био хелијум, брзина протока је била 1 ml/min. GC програм поставља Allium sativum на 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M и Ocimum Sainttum на 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 – 280, за менту 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280, за еукалиптус 20,60-1M-10-200-3M-30-280, а за црвени за хиљаду слојева то су им 10:60-1M-8-220-5M-8-270-3M.
Главна једињења сваког ЕО су идентификована на основу процента површине израчунатог из резултата ГЦ хроматограма и масене спектрометрије (референцирано на базу података стандарда NIST 70).
Два главна једињења у сваком ЕО су одабрана на основу резултата ГЦ-МС и купљена од Сигма-Олдрич-а у чистоћи од 98–99% за даља биолошка испитивања. Једињења су тестирана на ларвицидну и ефикасност код одраслих јединки против Aedes aegypti као што је горе описано. Најчешће коришћени синтетички ларвициди тамефосат (Сигма Олдрич) и лек за одрасле малатион (Сигма Олдрич) су анализирани да би се упоредила њихова ефикасност са одабраним ЕО једињењима, пратећи исту процедуру.
Бинарне смеше одабраних терпенских једињења и терпенских једињења плус комерцијалних органофосфата (тилфос и малатион) су припремљене мешањем LC50 дозе сваког кандидатског једињења у односу 1:1. Припремљене комбинације су тестиране на ларвалним и одраслим стадијумима Aedes aegypti као што је горе описано. Сваки биолошки тест је извршен у три примерка за сваку комбинацију и у три примерка за појединачна једињења присутна у свакој комбинацији. Смрт циљних инсеката је забележена након 24 сата. Израчунајте очекивану стопу смртности за бинарну смешу користећи следећу формулу.
где је E = очекивана стопа смртности комараца Aedes aegypti као одговор на бинарну комбинацију, тј. везу (A + B).
Ефекат сваке бинарне смеше је означен као синергистички, антагонистички или без ефекта на основу вредности χ2 израчунате методом коју је описао Павла52. Израчунајте вредност χ2 за сваку комбинацију користећи следећу формулу.
Ефекат комбинације је дефинисан као синергистички када је израчуната вредност χ2 била већа од табеларне вредности за одговарајуће степене слободе (95% интервал поверења) и ако је утврђено да је примећени морталитет премашио очекивани морталитет. Слично, ако израчуната вредност χ2 за било коју комбинацију премашује табеларну вредност са неким степенима слободе, али је примећени морталитет нижи од очекиваног морталитета, третман се сматра антагонистичким. А ако је у било којој комбинацији израчуната вредност χ2 мања од табеларне вредности у одговарајућим степенима слободе, сматра се да комбинација нема ефекат.
Три до четири потенцијално синергистичке комбинације (100 ларви и 50 ларвицидних и одраслих инсеката) су одабране за тестирање против великог броја инсеката. Одрасли) поступају као горе. Заједно са смешама, појединачна једињења присутна у одабраним смешама су такође тестирана на једнаком броју ларви и одраслих Aedes aegypti. Однос комбинације је један део LC50 дозе једног кандидата једињења и део LC50 дозе другог састојног једињења. У биолошком тесту активности одраслих, одабрана једињења су растворена у растварачу ацетону и нанесена на филтер папир умотан у цилиндричну пластичну посуду од 1300 цц. Ацетон је испараван 10 минута и одрасле јединке су пуштене. Слично, у ларвицидном биолошком тесту, дозе LC50 кандидата једињења су прво растворене у једнаким запреминама DMSO, а затим помешане са 1 литром воде ускладиштене у пластичним посудама од 1300 цц, а ларве су пуштене.
Пробабилистичка анализа 71 забележеног податка о морталитету извршена је коришћењем SPSS (верзија 16) и Minitab софтвера за израчунавање LC50 вредности.
Време објаве: 01.07.2024.